一种电化学生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种电化学生物传感器，是基于电诱导电活性染料和蛋白质的空间位阻的新型电化学均相生物传感平台，用于同时检测血清中的四种参数指标以及分型检测。本发明专利技术采用多孔UiO

An electrochemical biosensor and its application

【技术实现步骤摘要】
一种电化学生物传感器及其应用


[0001]本专利技术涉及一种电化学生物传感器及其应用，具体涉及基于电诱导电活性染料以及蛋白的空间位阻效应构建均相电化学生物传感器，及其应用于血清中识别雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体
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2（HER
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2）和细胞增殖生物标志物（Ki
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67)四种生物标志物以及应用于血清中乳腺癌分型检测的方法。

技术介绍

[0002]现有技术中，基于基因芯片、免疫组化、基因组学等检测手段识别雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体
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2（HER
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2）和细胞增殖生物标志物（Ki
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67)四种生物标志物的方法都存在明显的不足。要么只能对一些关键分子进行定性和半定量研究。关键分子与临床信息之间的相互关系无法实时显示，难以准确揭示肿瘤进展过程，难以在宏观形态上综合评价肿瘤侵袭行为。更重要的是，这些技术需要从体内提取和处理肿瘤细胞或组织标本，失去了原发肿瘤的三维信息，侵入性检测方法可能导致肿瘤转移。
[0003]尽管本领域研究人员专注于在同一系统上检测单个或多个生物标志物，但目前还没有同时检测四种生物标志物以在血清中通过检测HER2、ER、PR和Ki67来分析乳腺癌分子类型的电化学平台。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的在于提供一种电化学生物传感器及其应以获得高灵敏度检测结果，特别是同时检测血清中的雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体
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2（HER
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2）和细胞增殖生物标志物（Ki
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67)四种生物标志物并进行乳腺癌分子分型诊断。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种电化学生物传感器，其特征在于，采用多孔UiO
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66
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NH2作为纳米容器负载电活性碱性染料
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NR、TB、TMB和MG，具体为NR@UiO
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66 、TB@UiO
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66、TMB@UiO
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66、MG@UiO
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66)。进一步，其制备方法包括：（1）UiO
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66
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NH2的制备：将215 mg氨基对苯二甲酸和75 mg氯化锆溶解在20 mL DMF和1.5 mL乙酸的混合溶液中，超声15分钟；将混合溶液转移到反应器中，在120℃的高温下水热反应8小时；反应结束后，自然冷却至室温的UiO
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66
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NH2产物干燥，10000rpm离心10min。然后用无水乙醇洗涤产物并真空干燥；（2）吸附电活性染料：取5mgUiO
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66
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NH2纳米颗粒分别与25 mL染料
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NR、TB、TMB和MG混合物的溶液将20 mg/L的浓度（每种染料10 mg/L）混合，得到NR@UiO
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66 、TB@UiO
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66、TMB@UiO
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66、MG@UiO
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66；在25℃下吸附三小时后，吸附剂被分离，UV
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Vis进行光谱分析以确定染料浓度；（3）修饰抗体：将1 mL的0.1 M EDC（1
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乙基
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（3
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二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺）分别加入1 ng/mL的200 ul HER2、ER、Ki67和PR抗体溶液中（用PBS溶液稀释原液得到）；EDC与
抗体的羧基反应，在室温下30分钟内产生活性酯中间体；之后，将0.1M NHS（N
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羟基琥珀酰亚胺）和0.015 g NR@UiO
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66 、TB@UiO
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66、TMB@UiO
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66、MG@UiO
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66；重新悬浮到上述相应的溶液中，使 UiO
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66
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NH2在4℃搅拌16小时；然后将溶液离心，再分别用0.01 M PBS洗涤六次；离心后，未反应的基团用BSA（牛血清蛋白）溶液封闭，用PBS缓冲液洗涤，得到HER2
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antibody@NR@UiO
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66、ER
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antibody@TB@UiO
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66、Ki67
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antibody@TMB@UiO
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66、PR
ꢀ‑
antibody@MG@UiO
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66探针；最后将上述四种UiO
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66探针混合后放入冰箱冷藏备用。
[0006]本专利技术还提供一种电化学生物传感器的应用，采用上述电化学生物传感器用于血清中识别雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体
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2（HER
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2）和细胞增殖生物标志物（Ki
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67)四种生物标志物。
[0007]进一步，用于血清中识别所述四种生物标志物的方法，包括如下步骤：（1）将ITO电极逐渐放入洗涤剂溶液（8g/L）、异丙醇、丙酮和超纯水中20分钟，确保电极表面清洁干净；然后将ITO电极浸入氢氧化钠溶液（1mM）中，室温浸泡5小时，使电极表面带负电；再次用超纯水超声20分钟，用氮气吹干，保存备用；（2）混合10 μL四种不同浓度的染料@MOF材料样品，加入100pg/mL HER2、ER、PR和Ki67四种目标蛋白，混合液37℃孵育60分钟；离心后，再分散于等体积的PBS溶液中，然后加入三电极体系（氯化银作为参比电极，铂丝作为对电极，ITO作为工作电极），以
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0.3 V，200 s为周期进行扫描；再利用电化学工作站测量ITO电极表面的DPV信号，观察蛋白质浓度对SWV信号的影响；（3）将10ul含有所述四种生物标志物的血清样品稀释在90ul的0.01M PBS溶液中，进行检测，电化学测量程序与上述四种生物标志物检测的程序一致。
[0008]相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术提供的基于电诱导电活性染料和蛋白质的空间位阻的新型电化学均相生物传感平台，用于同时检测血清中的四种参数指标；采用多孔UiO
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66
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NH2作为纳米容器负载电活性碱性染料
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NR、NB、TMB和MG（染料与UiO
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66纳米材料之间的表面力为∏
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∏）（NR@UiO 、TB@UiO、TMB@UiO、MG@UiO）。由于碱性染料与ITO电极（表面带负电）之间的相互吸引力小于染料与MOF材料表面的相互作用，在均相溶液中，ITO表面不会吸附或吸附少量阳离子染料的量。在ITO电极上施加负电压后，由于负电压本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电化学生物传感器，其特征在于，采用多孔UIO
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NH2作为纳米容器负载电活性碱性染料
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NR、TB、TMB和MG，具体为NR@UiO
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66 、TB@UiO
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66、TMB@UiO
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66、MG@UiO
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66)。2.如权利要求1所述电化学生物传感器，其特征在于，其制备方法包括：（1）UIO
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NH2的制备：将215 mg氨基对苯二甲酸和75 mg氯化锆溶解在20 mL DMF和1.5 mL乙酸的混合溶液中，超声15分钟；将混合溶液转移到反应器中，在120℃的高温下水热反应8小时；反应结束后，自然冷却至室温的UiO
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NH2产物干燥，10000rpm离心10min；然后用无水乙醇洗涤产物并真空干燥；（2）吸附电活性染料：取5mgUiO
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NH2纳米颗粒分别与25 mL染料
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NR、TB、TMB和MG混合物的溶液将20 mg/L的浓度（每种染料10 mg/L）混合，得到NR@UiO
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66 、TB@UiO
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66、TMB@UiO
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66、MG@UiO
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66；在25℃下吸附三小时后，吸附剂被分离，UV
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Vis进行光谱分析以确定染料浓度；（3）修饰抗体：将1 mL的0.1 M EDC（1
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乙基
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（3
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二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺）分别加入1 ng/mL的200 ul HER2、ER、Ki67和PR抗体溶液中（用PBS溶液稀释原液得到）；EDC与抗体的羧基反应，在室温下30分钟内产生活性酯中间体；之后，将0.1M NHS（N
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羟基琥珀酰亚胺）和0.015 g NR@UiO
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66 、TB@UiO
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66、TMB@UiO
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【专利技术属性】
技术研发人员：侯长军，张亚，霍丹群，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：