一种NphB突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种NphB芳族异戊二烯基转移酶的突变体及其应用，其中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11所示。本发明专利技术还公开了一种大麻萜酚酸的制备方法，其包括以下步骤：在反应体系中，利用所述的突变体催化香叶基焦磷酸和橄榄醇酸生成大麻萜酚酸。本发明专利技术在提高芳香族异戊二烯基转移酶的酶活的同时提升了CBGA的产量。活的同时提升了CBGA的产量。

An nphb mutant and its application

【技术实现步骤摘要】
一种NphB突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种NphB突变体、一种大麻萜酚酸的制备方法以及NphB突变体在制备大麻萜酚酸中的用途。

技术介绍

[0002]大麻素是一类具有多种生物活性的化合物，可分为三类：(1)内源性大麻素，天然存在于人体，并且可以在人体中产生；(2)植物大麻素，仅存在于大麻植物中；(3)实验室合成大麻素。大麻素已显示出具有若干有益的医学/治疗作用，因此，大麻素是制药工业研究的活跃领域，可用作各种不同疾病的药物产品。
[0003]目前已知的植物大麻素超过了80种，主要包括四氢大麻酚(THC，致幻成瘾成分)、大麻二酚(CBD，非精神成分活性)、大麻环萜酚(CBC)、大麻酚 (CBN)、大麻萜酚(CBG)等。
[0004]大麻素由酸性大麻素在加热或长期储存条件下脱羧形成，如四氢大麻酚酸(THCA)形成THC、大麻二酚酸(CBDA)形成CBD和大麻环萜酚酸(CBCA) 形成CBC。而CBGA是通过氧化环化酶转化为酸性大麻素如THCA、CBDA 或CBCA的分支点中间体，反应路径如下，因此CBGA对THC、CBD、CBC的生产至关重要。
[0005][0006]现有技术中多以橄榄酸和香叶基二磷酸(Gpp)经芳香族异戊二烯基转移酶(Aromatic prenyltransferase，PTase)催化的酶促方法合成CBGA，如萨斯喀彻温大学在专利US20150128301A1中公开的来自大麻的芳香族异戊二烯基转移酶，该酶被命名为CsPT1(Cannabis sativa prenyltransferase 1)。另外， LIBREDE在US20200017889A1中，也将CsPT1或其相似的基因插入酵母 (S.cerevisiae)中，从而将橄榄酸转化为CBGA。
[0007]中国专利CN110892075A也公开了一种在遗传修饰的酵母中生产大麻素的方法，其酵母中含有来自链霉属菌种CL190菌株的NphB (hydroxynaphthalene PTase)(即野生型NphB)(Bonitz等，PLos ONE，2011， 6(11)，e27336；Kuzuyama等，2005，Nature，435，983
‑
987；Zirpel等，Journalof Biotechnology 259(2017)，204
‑
212)或是其突变体Q161A的可溶性芳族异戊二烯基转移酶。NphB(Q161A)与野生型NphB相比能产生更多的 CBGA(Muntendam 2015)。德国专利DE102018117233A1则公布了将编码修饰的NphB突变体的基因导入宿主生物体并表达生产CBGA的方法。其中经过修饰的NphB突变体(Q295F和Q295H)相对于野生型NphB(此专利文献中SEQ ID NO:2)CBGA的合成量显著提高，CBGA相对于2
‑
O
‑
香叶基橄榄酸提高了20倍。
[0008]然而现有技术中的芳香族异戊二烯基转移酶酶活仍然还有待提高，以产生尽可能大量的CBGA。

技术实现思路

[0009]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种改进的芳香族异戊二烯基转移酶，具体为一种改进的NphB酶，以提高CBGA的产量。
[0010][0011]本专利技术的第一方面提供一种NphB芳族异戊二烯基转移酶的突变体所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11所示。
[0012]较佳地，编码所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 12所示。
[0013]本专利技术的第二方面提供一种分离的核酸，其编码本专利技术第一方面所述的突变体。
[0014]本专利技术第三方面提供一种重组表达载体，其包含本专利技术第二方面所述的分离的核酸；所述重组表达载体优选pET28a质粒。
[0015]本专利技术第四方面提供一种转化体，其含有本专利技术第二方面所述的分离的核酸，或本专利技术第三方面所述的重组表达载体；所述转化体构建时使用的宿主优选为大肠杆菌，例如E.coli BL21(DE3)。
[0016]本专利技术第五方面提供一种制备本专利技术第一方面所述的突变体的方法，其包括培养本专利技术第四方面所述的转化体获得发酵产物，并从发酵产物中获得所述突变体；
[0017]所述方法优选地还包括纯化所述突变体的步骤；
[0018]所述方法更优选地使用Ni柱对所述突变体进行纯化。
[0019]本专利技术第六方面提供一种大麻萜酚酸的制备方法，其包括以下步骤：在反应体系中，利用本专利技术第一方面所述的突变体催化香叶基焦磷酸和橄榄醇酸生成大麻萜酚酸。
[0020]较佳地，所述反应体系包括1mM～10mM的香叶基焦磷酸，优选2.5mM 或5mM；2mM～20mM的橄榄醇酸，优选5mM或10mM。
[0021]在某一较佳实施例中，所述突变体的终浓度为0.5g/mL～1.5g/mL，优选 1g/mL；
[0022]所述反应体系中包括1mM～10mM的MgCl2，优选5mM MgCl2；
[0023]所述反应体系的pH为7.5～8.5，优选为8.0；
[0024]所述催化在30～40℃下进行，优选30℃；
[0025]所述催化的时间为1～6小时。
[0026]本专利技术第六方面提供本专利技术第一方面所述的突变体、本专利技术第二方面所述的分离的核酸、本专利技术第三方面所述的重组表达载体或者本专利技术第四方面所述的转化体在制备大麻萜酚酸或大麻素的应用。
[0027]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。
[0028]本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0029]本专利技术的积极进步效果在于：提高芳香族异戊二烯基转移酶的酶活，同时提升CBGA的产量。
具体实施方式
[0030]下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0031]本专利技术中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参考J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
[0032]本专利技术中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1所示。
[0033]表1
[0034][0035]所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表2所示。
[0036]表2
[0037][0038][0039]质粒pBAD购买自Novagen公司；DpnI酶、NdeI酶、HindIII酶购买自 Thermo Fisher公司；ExnaseⅡ酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司；E.coliBL21(DE3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；橄榄醇酸(OA)由实验室合成；香叶基焦磷酸(G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NphB芳族异戊二烯基转移酶的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11所示。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，编码所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示。3.一种分离的核酸，其编码如权利要求1或2所述的突变体。4.一种重组表达载体，其包含如权利要求3所述的分离的核酸；所述重组表达载体优选pET28a质粒。5.一种转化体，其含有如权利要求3所述的分离的核酸，或如权利要求4所述的重组表达载体；所述转化体构建时使用的宿主优选为大肠杆菌，例如E.coliBL21(DE3)。6.一种制备如权利要求1或2所述的突变体的方法，其包括培养如权利要求5所述的转化体获得发酵产物，并从发酵产物中获得所述突变体；优选地，还包括纯化所述突变体的步骤；更优选地，使用Ni柱对所述突变体进行纯化。7.一种大麻萜酚酸的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：王舒，田振华，吴燕，包文艳，邢丽彤，
申请(专利权)人：弈柯莱生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：