一种DNA分子的扩增引物设计和连接方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA分子的扩增引物设计和连接方法，特别是提高Pacbio扩增子测序有效数据量的建库方法。包括针对DNA分子设计不同的引物对，使用不同的引物对分别在不同扩增体系中对所述模板DNA进行PCR扩增。本发明专利技术将较短的PCR产物进行连接，得到较长的文库，使用连接后的文库进行上机测序，可以在保证数据质量的同时，大幅提高数据利用率。大幅提高数据利用率。

A method of primer design and ligation for DNA amplification

【技术实现步骤摘要】
一种DNA分子的扩增引物设计和连接方法


[0001]本专利技术属于生物测序领域，具体涉及一种DNA分子的扩增引物设计和连接方法，特别是一种提高Pacbio扩增子测序数据量的建库方法。

技术介绍

[0002]在某些测序应用领域中，建库需要进行扩增，且插入片段较长，需要用到长读长测序，如全长16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序、靶基因测序、全长转录组测序和靶向全长转录组测序等，在Pacbio长读长测序平台中，其测序试剂经过几个版本的发展，现已将酶读长提升到60k以上，由于Pacbio测序芯片每个孔只能读取一个文库分子，造成扩增产物所形成的文库分子在测序孔中被反复读取，造成了酶读长的冗余和浪费。
[0003]目前不同的应用中，得到扩增产物后构建Pacbio文库的常规过程为：扩增产物
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>DNA损伤修复
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>末端修复
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>磁珠纯化
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>接头连接
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>去除不完整文库
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>磁珠纯化。
[0004]常规建库流程：在通过扩增(如使用16S rDNA全长引物对微生物基因组进行扩增)得到PCR产物后，进行DNA损伤修复，加上测序接头，使用消化酶去除不完整文库，纯化后得到测序文库。
[0005]通常扩增子的长度和全长转录组的的平均长度较短，扩增子16S rDNA长度约为1.5k，18S rDNA长度约为1.8k，全长转录组平均长度小于2k，免疫细胞TCR/BCR全长转录本长度约为1
‑
1.8k。常规建库所得到的对应文库平均长度也均低于2k，而Pacbio测序平台的酶读长可达到60k以上，即单个文库分子测序轮数达到30轮以上。根据统计，测序轮数达到6轮就已足够对序列进行准确的分析。所以多出来的测序数据量则是大量的数据冗余，即现有的建库方式无法充分利用Pacbio平台酶读长的优势。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是为克服现有技术中针对现有的扩增产物的建库方式无法充分利用Pacbio平台酶读长优势的缺陷提供一种DNA分子的扩增引物设计和连接方法，设计了首尾相连建库的方案，将PCR产物通过粘性末端进行首尾相连，从而增加文库的平均长度，这样在测序后可得到更多的有效数据。
[0007]本专利技术主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0008]本专利技术提供一组PCR引物对，不同引物对之间的关联为：两两不同对引物之间，一个引物对的正向引物和另一个引物对的反向引物的不同在于5
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端的n个碱基不同，所述n个碱基中第一个碱基为A，第n个碱基为dU；所述n为大于等于4的整数；
[0009]第1个引物对的正向引物和最后一个引物对的反向引物之间不存在所述特征关联。
[0010]以上所述的n优选4～30；较佳地为6。
[0011]本专利技术还提供一种DNA分子的扩增方法，所述的扩增方法包括针对DNA分子设计不同的引物对，使用不同的引物对分别在不同扩增体系中对所述模板DNA进行PCR扩增；不同
的引物对之间的特征关联为：
[0012]两两不同对引物之间，一个引物对的正向引物和另一个引物对的反向引物的不同在于5
’
端的n个碱基不同，所述n个碱基中第一个碱基为A，第n个碱基为dU；所述n为大于4的整数；
[0013]第1个引物对的正向引物和最后一个引物对的反向引物之间不存在所述特征关联。
[0014]其中，所述n较佳地为30以下，更佳地为6。
[0015]本专利技术中所述的扩增方法，较佳地还包括：在进行所述PCR扩增后，连接不同扩增体系所得扩增产物，优选通过去除扩增产物的dU碱基以产生黏性末端的方式进行所述连接。较佳地使用USER酶中的Uracil
‑
DNA Glycosylase(UDG)和Endonuclease VIII将dU碱基消化去除。
[0016]本专利技术还提供一种提高Pacbio扩增子测序数据量的建库方法，其包括如本专利技术第一方面所述的扩增方法。
[0017]在本专利技术一具体实施方案中，对模版进行PCR前，将PCR体系分为n管，不同管加入不同的PCR引物，不同对引物(除管1的正向引物和管n的反向引物外)的正向引物或反向引物间仅有5
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端的若干个连接序列不同，连接序列的5
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端第一个碱基为A，最后一个碱基为dU(如5
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端有6个碱基的连接序列，则第一个碱基为A，第6个碱基为dU)。经过USER酶中的Uracil
‑
DNA Glycosylase(UDG)和Endonuclease VIII可将dU碱基消化去除，从而产生一段黏性末端，黏性末端系列特性为A产物仅与B产物1进行连接，B产物1仅与A产物和B产物2进行连接，B产物n
‑
1仅与B产物n
‑
2和B产物n进行连接，B产物n仅与B产物n
‑
1和C产物进行连接。将带有黏性末端的产物用DNA连接酶进行连接，由于黏性末端的序列的特性，不同产物之间会按顺序进行首尾连接。
[0018]由于连接酶的连接效率不是100％，连接产物中含有部分nick，需进行PCR扩增筛选出完整连接的产物，管1的正向引物和管n的反向引物的5
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端不带dU且可作为筛选PCR的引物结合位置。PCR产物加测序接头后可得到标准的哑铃状文库。
[0019]本专利技术通过设计一套带dU的引物，在Pacbio扩增子建库过程，使固定个数的扩增片段进行顺序连接后建库测序，可充分利用Pacbio测序的超长读长。
[0020]本专利技术可应用于利用Pacbio测序来获取扩增子如全长转录本、16S、18S和其他目的基因片段扩增子的序列信息的领域。
[0021]本专利技术基于Pacbio官方全长转录组建库流程，经过重新设计建库过程，通过转录本PCR产物的连接，来增加文库的长度，从而提高测序数据的可利用率。
[0022]本专利技术还提供一种提高Pacbio扩增子测序数据量的建库方法，其包括如上所述的扩增方法。
[0023]本专利技术还提供一种全长转录组测序的方法，其包括如上所述的扩增方法。
[0024]本专利技术还提供如上所述的PCR引物对在DNA分子扩增、提高Pacbio扩增子测序数据量或者全长转录组测序中的应用。
[0025]本专利技术还提供一组用于扩增TCR/BCR cDNA的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO:1～8所示。
[0026]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实
例。
[0027]本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0028]本专利技术的积极进步效果在于：
[0029]本专利技术将较短的PCR产物进行连接，得到较长的文库，使本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组PCR引物对，其特征在于，不同引物对之间的关联为：两两不同对引物之间，一个引物对的正向引物和另一个引物对的反向引物的不同在于5
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端的n个碱基不同，所述n个碱基中第一个碱基为A，第n个碱基为dU；所述n为大于等于4的整数；第1个引物对的正向引物和最后一个引物对的反向引物不存在所述特征关联。2.如权利要求1所述的PCR引物对，其特征在于，所述n为4～30；较佳地为6。3.一种DNA分子的扩增方法，其特征在于，其包括针对DNA分子设计不同的引物对，使用不同的引物对分别在不同扩增体系中对所述模板DNA进行PCR扩增；不同的引物对之间的特征关联为：两两不同对引物之间，一个引物对的正向引物和另一个引物对的反向引物的不同在于5
’
端的n个碱基不同，所述n个碱基中第一个碱基为A，第n个碱基为dU；所述n为大于等于4的整数；第1个引物对的正向引物和最后一个引物对的反向引物之间不存在所述特征关联。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈智超，唐冲，阮凤英，李娅宁，郭梅，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技服务有限公司，
类型：发明
国别省市：