白藜芦醇-3-糖基转移酶及其在虎杖苷合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种白藜芦醇

【技术实现步骤摘要】
白藜芦醇
‑3‑
糖基转移酶及其在虎杖苷合成中的应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及白藜芦醇
‑3‑
糖基转移酶及其在虎杖苷合成中的应用。

技术介绍

[0002]虎杖苷(3
‑
糖基白藜芦醇)(结构如下所示)是传统中草药虎杖有效成分，被广泛用于治疗心血管疾病和癌症。白藜芦醇的3位糖基化是虎杖苷的主要结构特点。在植物天然产物的生物合成过程中，糖基化是糖基转移酶(glycosyltransferase)通过催化糖基从供体分子如UDP
‑
葡萄糖、UDP
‑
木糖、UDP
‑
鼠李糖、UDP
‑
葡萄糖醛酸转移到受体分子的过程，从而形成各种具有生物活性的糖苷类化合物。这一类酶具有较广的底物谱。
[0003][0004]虎杖苷主要是从廖科植物虎杖(Polygonum cuspidatum)的根茎提取获得，但是虎杖植株的生长极易受气候、地理环境和虫害的影响。近年来，随着生物技术的不断进步，合成生物学的快速发展有效的解决了植物提取法面临的困难。微生物合成法不仅具有操作简便、自然资源破坏少的优点，并且能克服化学合成法存在的环境污染问题。但是，目前尚无虎杖来源的白藜芦醇
‑3‑
糖基转移酶(Resveratrol
‑3‑
glycosyltransferase,R3GAT)的相关报道，因此本领域迫切需要筛选到相应的R3GAT并开发一种生物法合成虎杖苷的方法。

技术实现思路

[0005]为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供了一种白藜芦醇
‑3‑
糖基转移酶及其编码基因与应用。
[0006]本专利技术另一个目的是提供一种底盘细胞及其制备方法以及利用此底盘细胞筛选白藜芦醇
‑3‑
糖基转移酶的方法。
[0007]本专利技术再一目的是提供一种生产虎杖苷的底盘细胞。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0009]本专利技术的第一方面，提供一种具有催化白藜芦醇3
‑
羟基糖基化活性的蛋白质，其包括：
[0010](a)具有如SEQ ID NO.1、2、3所示任一氨基酸序列的蛋白；或
[0011](b)含有(a)的融合蛋白；或
[0012](c)序列中含有(a)或(b)中所述蛋白序列的衍生蛋白；或
[0013](d)将SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的蛋白经过一个或多个氨基酸残基(较佳地，1
‑
50个，更佳地，1
‑
30个，更佳地，1
‑
10个，最佳地，1
‑
6个)的取代、缺失或添加而形成的，并具有催化白藜芦醇3
‑
羟基糖基化活性的衍生蛋白；或
[0014](e)与(a)
‑
(d)任一项所述的蛋白同源性高于90％、95％、96％、97％、98％或99％，并具有催化白藜芦醇3
‑
羟基糖基化活性的衍生蛋白。
[0015]在另一优选实施方案中，所述的序列(c)为由(a)或(b)添加了标签序列(包括His标签、GST标签、可溶性标签等)、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。
[0016]本专利技术的第二方面，提供一种编码上述蛋白质的基因。
[0017]优选地，上述基因包括：
[0018](a)具有如SEQ ID NO.4、5、6任一所示核苷酸序列；或
[0019](b)翻译后可以生成如SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的核苷酸序列；或
[0020](c)在SEQ ID NO.4、5、6所示核苷酸序列的5
’
端和/或3
’
端截短或添加1
‑
60个(较佳地1
‑
30，更佳地1
‑
10个)核苷酸所形成的核苷酸序列，且编码具有催化白藜芦醇3
‑
羟基糖基化活性的蛋白质的DNA分子；或
[0021](d)与(a)或(b)或(c)限定的DNA序列具有90％、95％、98％、99％以上同源性，且编码具有催化白藜芦醇
‑3‑
位羟基化活性的蛋白质的DNA分子；或
[0022](e)在严格条件下与(a)或(b)或(c)或(d)限定的DNA序列杂交且编码具有催化白藜芦醇3
‑
羟基化活性的蛋白质的DNA分子。
[0023]上述严格条件可为用0.1
×
SSPE(或0.1
×
SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
[0024]含有上述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌均属于本专利技术的保护范围。
[0025]本专利技术第三方面，提供一种含有上述基因的重组表达载体或表达盒。
[0026]本专利技术中，所述重组表达载体包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其他载体。适用于本专利技术的载体包括但不限于：穿梭质粒载体；在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET
‑
28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的破MSXND表达载体等。只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。优选质粒载体，如穿梭质粒载体。
[0027]本专利技术第四方面，提供一种宿主细胞，其包括一种、两种或两种以上编码上述蛋白质的多核苷酸的重组载体或表达盒。
[0028]在本专利技术中，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选的实例包括酵母。
[0029]本专利技术第五方面，提供上述蛋白质作为白藜芦醇
‑3‑
糖基转移酶的应用。
[0030]本专利技术第六方面，提供上述蛋白质、含有上述基因的重组表达载体、含有上述基因的表达盒、含有上述基因的宿主细胞在催化芪类化合物的合成中的应用；优选地，所述芪类化合物为虎杖苷。
[0031]本专利技术第七方面，提供一种底盘细胞，所述的底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产UDP
‑
葡萄糖能力的基因。
[0032]优选地，所述底盘细胞是用于生产UDP
‑
葡萄糖的真核菌株，能同时表达PGM1、PGM2和UGP1。
[0033]优选地，所述底盘细胞是在该真核菌株的基因组中整合表达PGM1、PGM2和UGP1；该整合为整合在该真核菌株的基因组的多拷贝位点。
[0034]在本专利技术中，所述PGM1为磷酸葡萄糖变位酶1，参与糖原合成途径，将葡萄糖
‑6‑
磷酸转变为葡萄糖
‑1‑
磷酸。
[0035]在本专利技术中，所述PGM2为α
‑
磷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有将白藜芦醇3
‑
羟基进行糖基化修饰的蛋白质，其特征在于，包括：(a)具有如SEQ ID NO.1、2、3所示任一氨基酸序列的蛋白；或(b)含有(a)的融合蛋白；或(c)序列中含有(a)或(b)中所述蛋白序列的衍生蛋白；(d)将SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的蛋白经过一个或多个氨基酸残基(较佳地，1
‑
50个，更佳地，1
‑
30个，更佳地，1
‑
10个，最佳地，1
‑
6个)的取代、缺失或添加而形成的，并具有催化白藜芦醇3
‑
羟基糖基化活性的衍生蛋白；或(e)与(a)
‑
(d)任一项所述的蛋白同源性高于90％、95％、96％、97％、98％或99％，并具有催化白藜芦醇3
‑
羟基糖基化活性的衍生蛋白；优选地，(c)中衍生蛋白由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白；优选地，所述标签序列包括His标签、GST标签、可溶性标签。2.权利要求1所述蛋白质作为白藜芦醇
‑3‑
糖基转移酶的应用。3.一种编码权利要求1所述的蛋白质的基因；优选地，所述基因包括：(a)具有如SEQ ID NO.4、5、6任一所示核苷酸序列；或(b)翻译后可以生成如SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(c)在SEQ ID NO.4、5、6所示核苷酸序列的5
’
端和/或3
’
端截短或添加1
‑
60个(较佳地1
‑
30，更佳地1
‑
10个)核苷酸所形成的核苷酸序列，且编码具有催化白藜芦醇3
‑
羟基糖基化活性的蛋白质的DNA分子；或(d)与(a)或(b)或(c)限定的DNA序列具有90％、95％、98％、99％以上同源性，且编码具有催化白藜芦醇
‑3‑
羟基糖基化活性的蛋白质的DNA分子；或(e)在严格条件下与(a)或(b)或(c)或(d)限定的DNA序列杂交且编码具有催化白藜芦醇3
‑
羟基糖基化活性的蛋白质的DNA分子；优选地，上述(e)中严格条件为用0.1
×
SSPE(或0.1
×
SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。4.一种含有权利要求3所述基因的重组表达载体或表达盒；优选地，所述重组表达载体为能在宿主细胞内稳定复制和存在，包括细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒；进一步优选地，适用于本发明的载体包括但不限于：穿梭质粒载体；在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体；在酵母中表达的载体；在哺乳动物细胞中表达的破MSXND表达载体；更优选地，为穿梭质粒载体。5.一种宿主细胞，其特征在于，包括一种、两种或两种以上编码权利要求1所述蛋白质的多核苷酸的重组载体或表达盒；优选地，所述宿主细胞是原核细胞或低等真核细胞或高等真核细胞；进一步优选地，所述宿主细胞为酵母。6.权利要求1所述的蛋白质、权利要求4所述的重组表达载体或表达盒、权利要求5所述的宿主细胞在催化芪类化合物的合成中的应用；优选地，所述芪类化合物为虎杖苷。7.一种底盘细胞，其特征在于，所述的底盘细胞含有提高所述底盘细胞生产UDP
‑
葡萄糖能力的基因；优选地，所述底盘细胞是用于生产UDP
‑
葡萄糖的真核菌株，能同时表达PGM1、PGM2、UGP1；所述PGM1为磷酸葡萄糖变位酶1，所述PGM2为α
‑
磷酸葡萄糖变位酶，所述UGP1为尿苷
二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；优选地，所述底盘细胞是在所述真核菌株的基因组中整合表达PGM1、PGM2、UGP1；该整合为整合在该真核菌株的基因组的多拷贝位点；优选地，所述真核菌株为酵母菌；进一步优选为酿酒酵母W303
‑
1B；优选地，所述酿酒酵母W303
‑
1B的基因组的多拷贝位点为YORWΔ17位点，酿酒酵母W303
‑
1B中表达PGM1的基因是参考Gene ID:853732报道的序列信息，经过密码子优化获得；酿酒酵母W303
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1B中表达PGM2的基因是参考Gene ID:855131报道的序列信息，经过密码子优化获得；酿酒酵母W303
‑
1B中表达UGP1的基因是参考Gene ID:853830报道的序列信息，经过密码子优化获得；进一步优选地，表达PGM1的基因具有如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；表达PGM2的基因具有如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；表达UGP1的基因具有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；优选地，所述酿酒酵母W303
‑
1B中，PGM1、PGM2、UGP1基因以表达盒的形式整合到基因组中，表达盒包括基因、启动子、终止子；表达盒包括基因、启动子、终止子；所述启动子选自：pTEF1、pTPI1、pHXT7、pPGK1、pPYK1、pTPII、pGPM1、pADH1、pTDH3、pTEF2；所述终止子选自：tTDH2、tENO2、tPGT1、tCPS1、tIDP1、tPRM5、tHIS5、tFBA1、tPDC1、tRPS2；进一步优选地，本发明提供的真核菌株中，利用Gibson组装方法将表达PGM1的基因和表达PGM2的基因构建到T3载体，PGM1和PGM2分别在启动子pADH1、pTDH3和终止子tFBA1、tPDC1的控制下，表达UGP1的基因构建到T4载体，UGP1在启动子pTEF2和终止子tRPS2的控制下；T3和T4载体两端分别带有同源臂L3和L4，L4和L5；用引物L3
‑
F/L4
‑
R，L4
‑
F/L5
‑
R分别扩增L3

【专利技术属性】
技术研发人员：江会锋，刘甜，刘晓楠，刘宇倩，祝晓熙，程健，卢丽娜，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：