产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌及发酵生产方法技术

本申请涉及基因工程领域，具体涉及产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌及发酵生产方法。本发明专利技术通过敲除罗尔斯通氏菌H16中的葡萄糖激酶基因（glk）实现了以果糖、甘油、二氧化碳（CO2）为唯一碳源时产物葡萄糖的积累。而后通过阻断Entner

【技术实现步骤摘要】
产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌及发酵生产方法


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌及发酵生产方法。

技术介绍

[0002]气候变化正在造成新一轮的全球粮食危机，化石燃料的大量使用所释放的温室气体（如CO2）是造成极端天气出现的主要因素。因此，通过技术手段来消除大气中的CO2同时解除粮食危机迫在眉睫。葡萄糖作为一种能量物质，是一种由绿色植物通过光合作用合成的单糖，也是食品和饲料原料中物质的基本组成单元。同时，葡萄糖可被广泛添加于药物、调味品中。随着合成生物学技术的发展，利用代谢工程手段进行葡萄糖生产逐渐成为可能。
[0003]目前已有利用代谢工程手段生产葡萄糖的报道见于以大肠杆菌和酿酒酵母为宿主菌株。碳源包括可被直接利用的木糖、阿拉伯糖和先通过电化学方法转化为乙酸而后被菌株利用的CO2。通过敲除大肠杆菌的葡萄糖代谢通路能够以木糖和阿拉伯糖为碳源实现葡萄糖的合成。在以酿酒酵母为宿主菌株生产葡萄糖的代谢工程研究中，由于酿酒酵母无法直接利用CO2，需首先通过电化学方法将CO2转化为酿酒酵母可利用的乙酸，而后酿酒酵母以乙酸为直接碳源进行葡萄糖的合成，这种间接利用CO2的流程增加了生产过程的复杂性，提高了应用成本。目前尚无利用果糖和廉价的可再生碳源甘油为碳源生产葡萄糖的报道。
[0004]罗尔斯通氏菌H16（Cupriavidus necator H16）是一种兼性化能自养的革兰氏阴性菌株。由于其缺失6
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磷酸果糖激酶和6
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磷酸葡糖酸脱氢酶，造成了其缺失完整的糖酵解途径和磷酸戊糖途径。葡萄糖
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磷酸的代谢经由Entner
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Doudoroff（ED）途径生成丙酮酸而后进入三羧酸循环或供给聚([R]‑
3羟基丁酸)合成中。作为一个具有潜在“细胞农业”候选菌株，罗尔斯通氏菌H16能够利用广泛的有机物作为碳源（如果糖、甘油等），更为重要的是其通过Calvin
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Benson
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Bassham（CBB）循环可以直接以CO2作为碳源。罗尔斯通氏菌H16具有一个天然PHB合成途径，通过代谢途径的重构，可将该部分碳流量转向合成其他高附加值化合物。目前，利用代谢工程改造后的罗尔斯通氏菌H16已成功实现了以甘油或CO2为碳源的异丁醇、甲基酮、海藻糖和甘露糖的合成。

技术实现思路

[0005]为实现利用可再生物质及温室气体CO2进行葡萄糖生产，本专利技术提供了一种能够以果糖、甘油以及CO2为碳源生产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌。
[0006]本专利技术的再一目的是提供一种高效发酵生产葡萄糖的方法。
[0007]根据本专利技术的产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌，所述工程菌为敲除罗尔斯通氏菌的葡萄糖激酶基因、并敲除了Entner
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Doudoroff（ED）途径和聚([R]‑
3羟基丁酸)（PHB）合成途径中关键基因的突变型罗尔斯通氏菌，其中，被敲除的葡萄糖激酶基因为葡萄糖激酶编码基因glk（H16_B2564），其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述ED途径关键基因为葡萄糖
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磷酸脱氢酶的编码基因zwf1（H16_A0316）、zwf2（H16_B1501）和zwf3（H16_B2566），其核苷酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；所述PHB合成途径关键基因为聚([R]‑
3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1（H16_A1437）、乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA（H16_A1438）和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1（H16_A1439），其核苷酸序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。
[0008]根据本专利技术的构建产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌的方法，包括以下步骤：敲除的葡萄糖激酶基因为葡萄糖激酶编码基因glk（H16_B2564），构建突变型罗尔斯通氏菌底盘细胞；敲除ED途径和PHB合成途径中的关键基因，其中，被敲除的葡萄糖激酶基因为葡萄糖激酶编码基因glk（H16_B2564），其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述ED途径关键基因为葡萄糖
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磷酸脱氢酶的编码基因zwf1（H16_A0316）、zwf2（H16_B1501）和zwf3（H16_B2566），其核苷酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；所述PHB合成途径关键基因为聚([R]‑
3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1（H16_A1437）、乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA（H16_A1438）和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1（H16_A1439），其核苷酸序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。
[0009]本专利技术另一个目的是提供一种发酵生产葡萄糖的方法，包括如下步骤：摇瓶发酵上述的产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌株，得到葡萄糖。
[0010]根据本专利技术的发酵生产葡萄糖的方法，其中，利用以果糖、甘油或CO2为唯一碳源的培养基进行摇瓶发酵。
[0011]根据本专利技术的发酵生产葡萄糖的方法，其中，发酵培养基的配方为：3.5 g/L Na2HPO4，1.5 g/L KH2PO4，1.0 g/L (NH4)2SO4，80 mg/L MgSO4⋅
7H2O，1 mg/L CaSO4⋅
2H2O，0.56 mg/L NiSO4⋅
7H2O，0.4 mg/L柠檬酸铁，200 mg/L NaHCO3，分别添加4 g/L果糖、甘油或者充入H2:O2:CO2=8:1:1的混合气体作为碳源。
[0012]根据本专利技术的发酵生产葡萄糖的方法，其中，所述发酵培养基中添加卡那霉素抗生素终浓度为200 mg/L。
[0013]根据本专利技术的发酵生产葡萄糖的方法，其中，所述摇瓶发酵条件为温度30℃，转速200 rpm。
[0014]本申请的技术方案的优点：1. 利用罗尔斯通氏菌H16工程菌株进行葡萄糖合成的优势在于其不能利用葡萄糖，不需要对菌株进行改造即可实现产物的积累。同时，罗尔斯通氏菌H16具有广泛的底物谱。能够利用果糖、甘油等有机物作为碳源进行产物合成的同时，还具有高效的CO2固定能力，即能够直接利用CO2进行葡萄糖的合成，而不需要电化学手段的辅助。本申请通过代谢工程手段构建了一株以可再生底物（果糖、甘油）以及可直接以CO2为碳源合成葡萄糖的罗尔斯通氏菌H16工程菌株。基于该项技术，不但能够解决日益严峻的全球粮食短缺问题，同时也是一种高效消除大气中的温室气体的方法。
[0015]2. 为构建葡萄糖积累的工程菌株，首先需对参与葡萄糖代谢第一步反应的葡萄
糖激酶进行失活。而罗尔斯通氏菌H16野生型菌株是无法利用葡萄糖作为碳源的。因此，本专利技术首先对菌株中的葡萄糖激酶进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌，其特征在于，所述工程菌为敲除了葡萄糖激酶基因、ED途径和聚([R]
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3羟基丁酸)合成途径中关键基因的罗尔斯通氏菌，其中，所述葡萄糖激酶基因为葡萄糖激酶编码基因glk，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；被敲除的ED途径关键基因为葡萄糖
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磷酸脱氢酶的编码基因zwf1、zwf2和zwf3，所述基因zwf1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述基因zwf2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述基因zwf3的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；被敲除的聚([R]
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3羟基丁酸)合成途径关键基因为聚([R]
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3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1、乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA和乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1，所述聚([R]
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3羟基丁酸)聚合酶编码基因phaC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶编码基因phaA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶编码基因phaB1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。2.一种提高罗尔斯通氏菌的葡萄糖产率的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：敲除罗尔斯通氏菌的葡萄糖激酶基因，构建突变型罗尔斯通氏菌底盘细胞；敲除ED途径和聚([R]
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3羟基丁酸)合成途径中的关键基因，其中，所述葡萄糖激酶基因为葡萄糖激酶编码基因glk，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；被敲除的ED途径关键基因为葡萄糖
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磷酸脱氢酶的编码基因zwf1、zwf2和zwf3，所述基因zwf1的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓璐，张杰，姚斌，罗会颖，黄火清，苏小运，柏映国，涂涛，王苑，王亚茹，秦星，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：