一种黄曲霉毒素分解酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种黄曲霉毒素分解酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术提供的黄曲霉毒素分解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术提供的黄曲霉毒素分解酶能够在真核表达系统中异源高表达，易于后期的纯化和酶制剂的制备，适合工业化生产。另外，本发明专利技术提供的黄曲霉毒素分解酶能够高效的降解黄曲霉毒素B1且特异性强，具有对饲料和环境没有污染的优势。有对饲料和环境没有污染的优势。有对饲料和环境没有污染的优势。

【技术实现步骤摘要】
一种黄曲霉毒素分解酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，尤其涉及一种黄曲霉毒素分解酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是黄曲霉、寄生曲霉产毒株的有毒次级代谢产物，也是已知化学物质中致癌性最强的一类毒素，分为黄曲霉毒素B族和黄曲霉毒素G族，目前已经发现大约20种。
[0003]黄曲霉毒素广泛存在于饲料中，其中黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)含量占比最大，AFB1是已知化学物质中致癌性最强的一种，广泛存在于饲料中。AFB1超标的饲料可使动物患病、死亡，甚至通过动物让人致病。黄曲霉毒素结构稳定，在光、热和酸性条件下不易降解，传统的物理化学方法去毒效率不高、饲料营养损失巨大、难以规模化生产以及不能彻底去除AFT的毒性等缺点。与传统的物理化学方法相比，生物降解具有条件相对温和、成本低廉及不会对饲料营养造成破坏等优点，而黄曲霉毒素分解酶(ADTZ)降解黄曲霉毒素具有效率高、特异性强以及对饲料和环境没有污染的优势，代表了生物解毒的新方向，即生物降解是一种高效去除黄曲霉毒素的理想方法。但是现有的用于降解黄曲霉毒素的酶的降解效率不高，或不适合工业应用，目前还没有一种黄曲霉毒素降解率高，且适合工业生产的黄曲霉毒素分解酶。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种黄曲霉毒素降解率高且适合工业生产的黄曲霉毒素分解酶，能够高效的降解黄曲霉毒素B1且特异性强，具有对饲料和环境没有污染的优势。
[0005]另外，本专利技术的目的还在于提供一种编码上述黄曲霉毒素分解酶的基因、携带上述基因的重组载体、表达上述黄曲霉毒素分解酶的重组菌及其应用。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种黄曲霉毒素分解酶，所述黄曲霉毒素分解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术还提供了一种编码上述黄曲霉毒素分解酶的基因。
[0009]优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术还提供了一种携带上述基因的重组载体。
[0011]优选的，所述载体包括毕赤酵母表达质粒pPICZαB。
[0012]本专利技术还提供了一种表达上述黄曲霉毒素分解酶的重组菌。
[0013]优选的，所述菌包括毕赤酵母SMD1163。
[0014]本专利技术还提供了一种上述黄曲霉毒素分解酶或上述基因或上述重组载体或上述
重组菌在降解黄曲霉毒素中的应用。
[0015]优选的，所述应用包括降解饲料中的黄曲霉毒素。
[0016]本专利技术还提供了一种包含上述黄曲霉毒素分解酶的酶制剂。
[0017]本专利技术的有益效果：
[0018]本专利技术提供的黄曲霉毒素分解酶能够在真核表达系统中异源高表达，易于后期的纯化和酶制剂的制备，适合工业化生产。另外，本专利技术提供的黄曲霉毒素分解酶能够高效的降解黄曲霉毒素B1且特异性强，具有对饲料和环境没有污染的优势。
附图说明
[0019]图1为质粒pPICZαB的图谱；
[0020]图2为重组质粒pPICZαB
‑
AFB1的图谱；
[0021]图3为重组质粒的双酶切验证电泳图谱，其中M为KB ladder DNA Marker(从上到下10000、8000、6000、5000、4000、3000、2000、1000和500bp)，1为质粒pPICZαB电泳图谱，2为pPICZαB
‑
AFB1被限制性内切酶PstI和BamH I双酶切的电泳图谱(3122和2446bp)；
[0022]图4为黄曲霉毒素B1分解酶的活性。
具体实施方式
[0023]本专利技术提供了一种黄曲霉毒素分解酶，所述黄曲霉毒素分解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0024]在本专利技术中，所述黄曲霉毒素分解酶又称为黄曲霉毒素B1分解酶，能够高效的降解黄曲霉毒素B1且特异性强。本专利技术所述黄曲霉毒素分解酶(黄曲霉毒素B1分解酶，Aflatoxin
‑
detoxinfizyme，ADTZ)与本领域已知黄曲霉毒素分解酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)相比，对AFB1的降解能力显著增强。
[0025]本专利技术还提供了一种编码上述黄曲霉毒素分解酶的基因，优选的在编码基因5
’
端引入限制性酶切位点Pst I，3
’
端引入Sal I酶切位点，所述基因的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO.2所示。
[0026]本专利技术还提供了一种携带上述基因的重组载体。本专利技术对于载体的具体类型没有特殊限定，可为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒，在本专利技术中，所述载体优选的为毕赤酵母表达质粒pPICZαB(图1)。本专利技术对于将基因连接至载体中获得重组载体的具体方式没有特殊限定，获得的重组质粒为pPICZαB
‑
AFB1，如图2所示。
[0027]本专利技术还提供了一种表达上述黄曲霉毒素分解酶的重组菌，所述菌的种类优选为毕赤酵母SMD1163，毕赤酵母SMD1163基因组中的Pep4和prb1基因发生突变，造成蛋白水解酶A和蛋白水解酶B活性的丧失，可以保护表达产物免受降解，促进表达量的提高。
[0028]本专利技术还提供了一种上述黄曲霉毒素分解酶或上述基因或上述重组载体或上述重组菌在降解黄曲霉毒素中的应用，所述应用优选的包括降解饲料中的黄曲霉毒素。
[0029]本专利技术还提供了一种包含上述黄曲霉毒素分解酶的酶制剂。
[0030]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0031]实施例1
[0032]委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的黄曲霉毒素分解酶的基因(在编码基因5
’
端引入限制性酶切位点Pst I，3
’
端引入SalI酶切位点)，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因连接到毕赤酵母表达质粒pPICZαB(图1)的相应位点上，获得重组质粒pPICZαB
‑
AFB1(如图2所示)。获得重组质粒后，进行双酶切验证，结果如图3所示。限制性内切酶Sac I线性化连接黄曲霉毒素分解酶编码基因的pPICZαB
‑
AFB1，进行电转化进入毕赤酵母SMD1163，通过含有博莱霉素(Zeocin
TM
)的YPD平板来筛选阳性克隆子，得到表达黄曲霉毒素分解酶基因的重组毕赤酵母，记为实验组重组毕赤酵母。
[0033]以本领域已知黄曲霉毒素分解酶(氨基酸序列如SEQ ID NO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄曲霉毒素分解酶，其特征在于，所述黄曲霉毒素分解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码权利要求1所述黄曲霉毒素分解酶的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种携带权利要求2或3所述基因的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述载体包括毕赤酵母表达质粒pPICZαB。6.一种表达权利要求1所述黄曲霉毒素分解酶的重组菌。7.根据权利要求6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东升，于欣君，黄江丽，张国华，圣平，张志红，何力，计少石，
申请(专利权)人：江西省科学院生物资源研究所，
类型：发明
国别省市：