一种特异性调控山羊毛囊干细胞增殖的方法技术

本发明专利技术公开一种特异性调控山羊毛囊干细胞增殖的方法，构建circCOL1A1过表达载体和siRNA干扰载体，将过表达载体和干扰载体分别转染到毛囊干细胞中，从而特异性提高或降低山羊毛囊干细胞中circCOL1A1表达，利用本发明专利技术方法对山羊毛囊干细胞增殖分化进行调控，进而促进山羊毛囊干细胞的增殖和抑制其凋亡，该方法对山羊毛囊干细胞的调控以及优质笔料毛性形成的机制研究具有重要意义。成的机制研究具有重要意义。成的机制研究具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性调控山羊毛囊干细胞增殖的方法


[0001]本专利技术属于畜牧学领域，具体涉及一种特异性降低山羊毛囊干细胞circCOL1A1的siRNA及方法。

技术介绍

[0002]维持毛囊干细胞数量和干细胞分化水平对毛囊的发育以及优质笔料毛性状的形成至关重要，这一过程又受到多个生理、生物进程的影响，尤其是干细胞的增殖和分化进程。circRNAs作为非编码RNA家族的成员之一，其稳定性和保守性高于同样属于非编码RNA家族的microRNAs和Long noncoding RNAs。此外，circRNAs通过发挥miRNAs sponge作用、编码多肽、与蛋白质结合、调控基因转录或翻译，参与调控不同的生理进程，例如抑制或促进肿瘤细胞的增殖或迁移、促进成肌细胞的增殖分化、调控奶牛乳腺上皮细胞泌乳相关蛋白的表达、调控猪脂肪细胞分化和脂质代谢过程。然而，有关circRNAs对长江三角洲白山羊(笔料毛山羊)皮肤组织毛囊干细胞的调控作用、以及优质笔料毛性状形成的机制研究还未有报道。通过对长江三角洲白山羊颈脊部皮肤组织circRNAs测序和生物信息学分析发现，来源于COL1A1(Ⅰ型胶原蛋白α1链)基因的差异表达circRNA——circCOL1A1可能在调控毛囊发育(毛囊干细胞的增殖分化)和优质笔料毛的性状形成过程中发挥重要作用。

技术实现思路

[0003]本专利技术针对上述问题，提供一种特异性降低山羊毛囊干细胞circCOL1A1的siRNA及方法。
[0004]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种特异性降低山羊毛囊干细胞circCOL1A1的siRNA及方法，构建circCOL1A1过表达载体和siRNA干扰载体，将过表达载体和干扰载体分别转染到毛囊干细胞中，结合细胞免疫荧光染色、免疫组化、Western blotting、细胞周期和凋亡、EdU实验，探究circCOL1A1对毛囊干细胞增殖分化的调控作用，以揭示circCOL1A1对毛囊干细胞的调控作用。进一步佐证circCOL1A1的siRNA的作用和效果。
[0005]一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法，其特征在于，所述的方法为构建circCOL1A1的siRNA干扰序列，将干扰序列转染到毛囊干细胞中，从而特异性降低山羊毛囊干细胞中circCOL1A1表达。
[0006]优选的，所述siRNA干扰载体的序列选自如下序列：
[0007]序列名称序列(5
’
to 3
’
)序列编号CircCOL1A1
‑
si
‑
1AACTGGCCCCCCTGGTCCCSEQ ID NO.1CircCOL1A1
‑
si
‑
2TGGCCCCCCTGGTCCCACTSEQ ID NO.2CircCOL1A1
‑
si
‑
3CCCCCTGGTCCCACTGGTASEQ ID NO.3
[0008]。
[0009]优选的，所述转染的方法如下：
[0010](1)将生长活力旺盛并可以稳定传代的长江三角洲白山羊毛囊干细胞接种到对应的细胞培养板中，当细胞密度生长至50～60％时，更换培养板中原有培养液为Opti
‑
MEM培养基，所述原培养液为：20％胎牛血清+2％青
‑
链霉素+DMEM/F12；
[0011](2)以6孔板为例，根据干扰序列siRNA的浓度，将2μg的siRNA溶解于含有250μLOpti
‑
MEM的无RNase的1.5mL EP管中，标为A管；同时，轻轻吸取5.0μL的Lipofectamine3000溶解于含有250μL Opti
‑
MEM的无RNase的1.5mL EP管中，标B管，不可吹打混匀，室温静置5min；
[0012](3)将含有siRNA的A管缓慢加入含有Lipofectamine 3000的B管中，轻轻混匀，室温静置16min；
[0013](4)将第(3)所得混合液均匀悬浮滴加至不同规格培养板的孔中，上下或左右水平轻轻晃动培养板使其混匀，放入细胞培养箱中继续培养；
[0014](5)转染完成6小时后将Opti
‑
MEM培养液替换成新鲜细胞培养液，继续培养细胞，所述新鲜细胞培养液为：20％胎牛血清+2％青
‑
链霉素+DMEM/F12。
[0015]一种抑制山羊毛囊干细胞增殖的方法，其特征在于，所述的方法为构建circCOL1A1的过表达载体，将过表达载体转染到毛囊干细胞中，从而特异性提高山羊毛囊干细胞中circCOL1A1表达。
[0016]优选的，所述circCOL1A1的过表达载体的构建方法如下：
[0017]依据circCOL1A1的全长序列信息，设计出含有诱导成环序列的PCR扩增引物，以扩增circCOL1A1全长873bp的序列，经EcoR
‑
I和BamH
‑
I酶切连接到pLC5
‑
ciR载体中；所述引物序列如下：
[0018]序列名称序列(5
’
to 3
’
)序列编号上游引物CGGAATTCTAATACTTTCAGGGTCCCACTGGTATTCAAGGCSEQ ID NO.4下游引物CGGGATCCAGTTGTTCTTACAGGGGGGCCAGTTTTGCCATCSEQ ID NO.5
[0019]。
[0020]circCOL1A1“背靠背”引物和“聚敛”引物的设计与合成。所述的circCOL1A1的全长序列为873bp，由于circRNAs的特殊性，因此设计circRNAs“背靠背”引物需要跨拼接位点设计；“聚敛”引物的设计需要跨来源基因的外显子设计；最后将不同引物序列送至由上海生工(生物工程有限公司)合成。circCOL1A1的特异性引物序列如表1所示。所述的过表达载体和siRNA是circCOL1A1的全长序列信息，设计出含有诱导成环序列的PCR扩增引物，以扩增circCOL1A1全长873bp的序列，经EcoR
‑
I和BamH
‑
I酶切连接到pLC5
‑
ciR载体中；干扰靶位点的筛选和设计需要“跨越”全长序列的拼接位点。
[0021]优选的，所述转染的方法如下：
[0022](1)将生长活力旺盛并可以稳定传代的长江三角洲白山羊毛囊干细胞接种到对应的细胞培养板中，当细胞密度生长至50～60％时，更换培养板中原有培养液为Opti
‑
MEM培养基，所述原培养液为：20％胎牛血清+2％青
‑
链霉素+DMEM/F12；
[0023](2)以6孔板为例，根据过表达载体的浓度，将2μg的过表达载体溶解于含有250μLOpti
‑
MEM的无RNase的1.5mL EP管中，标为A管；同时，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法，其特征在于，所述的方法为构建circCOL1A1的siRNA干扰序列，将干扰序列转染到毛囊干细胞中，从而特异性降低山羊毛囊干细胞中circCOL1A1表达。2.根据权利要求1所述一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法，其特征在于，所述siRNA干扰载体的序列选自如下序列：序列名称序列(5
’
to 3
’
)序列编号CircCOL1A1
‑
si
‑
1AACTGGCCCCCCTGGTCCCSEQ ID NO.1CircCOL1A1
‑
si
‑
2TGGCCCCCCTGGTCCCACTSEQ ID NO.2CircCOL1A1
‑
si
‑
3CCCCCTGGTCCCACTGGTASEQ ID NO.3。3.根据权利要求1所述一种促进山羊毛囊干细胞增殖的方法，其特征在于，所述转染的方法如下：(1)将生长活力旺盛并可以稳定传代的长江三角洲白山羊毛囊干细胞接种到对应的细胞培养板中，当细胞密度生长至50～60％时，更换培养板中原有培养液为Opti
‑
MEM培养基，所述原培养液为：20％胎牛血清+2％青
‑
链霉素+DMEM/F12；(2)以6孔板为例，根据干扰序列siRNA的浓度，将2μg的siRNA溶解于含有250μL Opti
‑
MEM的无RNase的1.5mL EP管中，标为A管；同时，轻轻吸取5.0μL的Lipofectamine 3000溶解于含有250μL Opti
‑
MEM的无RNase的1.5mL EP管中，标B管，不可吹打混匀，室温静置5min；(3)将含有siRNA的A管缓慢加入含有Lipofectamine 3000的B管中，轻轻混匀，室温静置16min；(4)将第(3)所得混合液均匀悬浮滴加至不同规格培养板的孔中，上下或左右水平轻轻晃动培养板使其混匀，放入细胞培养箱中继续培养；(5)转染完成6小时后将Opti
‑
MEM培养液替换成新鲜细胞培养液，继续培养细胞，所述新鲜细胞培养液为：20％胎牛血清+2％青
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链霉素+DMEM/F12。4.一种抑制山羊...

【专利技术属性】
技术研发人员：李拥军，张柳明，王健，王强，吴希，孙晓梅，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：