用于冻干的无甘油PCR试剂及其冻干方法技术

本发明专利技术公开了一种用于冻干的无甘油PCR试剂，其特征在于：包括4X缓冲液和无甘油酶混合物，所述4X缓冲液包含40mM Tris

【技术实现步骤摘要】
用于冻干的无甘油PCR试剂及其冻干方法


[0001]本申请涉及一种用于冻干的无甘油PCR试剂及其冻干方法，属于生物分子检测


技术介绍

[0002]PCR技术操作简单，灵敏度高，被广泛应用于医学检验等领域，是病毒检测的重要技术之一。目前，液体的PCR检测试剂已经不能满足市场需求，PCR冻干粉检测试剂崭露头角，受到广泛关注。但是目前的冻干版本荧光定量PCR试剂均是低甘油，现有的冻干技术对甘油含量依赖极高，甘油含量需要显著低于0.01％，无甘油的液体试剂稳定性低，储存在2
‑
8℃，存储周期短，存储在低温条件时无甘油的保护和抗冻作用，极易发生蛋白聚集变性，扩增性能显著下降。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种用于冻干的无甘油PCR试剂，可以耐受反复冻融，具有很强的热稳定性。
[0004]本专利技术采用的技术手段为：
[0005]一种用于冻干的无甘油PCR试剂，包括4X缓冲液和无甘油酶混合物，所述4X缓冲液包含40mM Tris
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H2SO4，20mM KCl,1.5mM MgCl2，0.35mM dNTP mix，0.16mg/mL BSA；
[0006]所述无甘油酶混合物包含：0.4U/μL
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1U/μL逆转录酶，0.2U/μL
‑
0.4U/μL RNAase抑制剂，0.14U/μL
‑
0.2U/μL DNA聚合酶逆转录酶和12X冻干保护剂混合物；
[0007]所述12X冻干保护剂，占扩增试剂终体积的1/12，冻干保护剂在无甘油PCR试剂中的终浓度为：甘露醇0.75mM,海藻糖0.3mM，明胶质量浓度0.003％，PEG6000 0.6mM，PVP质量浓度0.006％，γ
‑
聚谷氨酸质量浓度0.006％。
[0008]本专利技术还公开了上述的无甘油PCR试剂的冻干方法，其步骤包括：
[0009](1)分别配置4X的缓冲液，以及含有12X冻干保护剂的无甘油酶混合物，混匀；
[0010](2)步骤(1)得到的混合物在
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45℃下预冻2
‑
6h；
[0011](3)保持
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45℃，抽真空，使混合物处于0.01mbar以下的真空环境中；
[0012](4)保持真空，体系在1h内升温至
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40℃，保持10h，然后在1h内升温至0℃，保持10h，完成第一阶段的干燥；
[0013](5)抽真空至0mbar，体系在1h内升温至25℃，保持4h，完成第二阶段的干燥；
[0014](6)升压至常压，升压速率2min<5Pa，得到冻干的无甘油PCR试剂。
[0015]本专利技术通过优化保护剂的最低添加量，同时添加r
‑
聚谷氨酸解决无甘油试剂的不稳定性，提供一种稳定性版本的无甘油可冻干PCR试剂。本专利技术的无甘油冻干PCR试剂是国内第一个已经实际做好投产准备的无甘油可冻干PCR试剂产品，具有很强的热稳定性，可储存在
‑
20℃，耐受
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20℃到室温的反复冻融，耐受37℃热加速处理，解决了无甘油试剂储存周期短，无法长期储存的问题。给生产试剂厂家提供了便利，可以无忧备货，下游应用客户可
以无忧下单。
附图说明
[0016]图1：无甘油冻干PCR试剂反复冻融后的稳定性。
[0017]图2：无甘油冻干PCR试剂热加速稳定性。
[0018]图3：无甘油冻干PCR试剂与普通无甘油试剂性能比较。
[0019]图4：无甘油冻干PCR试剂冻干后外观。
[0020]图5：无甘油冻干PCR试剂冻干后性能。
[0021]图6：无甘油冻干PCR试剂冻干后热加速外观和性能比较。
具体实施方式
[0022]实施例1无甘油冻干PCR试剂反复冻融稳定性和热加速性能验证方法。
[0023]1、反复冻融稳定性
[0024]无甘油冻干PCR试剂包含4X反应液和含12X冻干保护剂的酶mix。将对照试剂即不含12X冻干保护剂的试剂和无甘油冻干PCR试剂两组放在
‑
20℃冰箱反复冻融10次，测试不含12X冻干保护剂的试剂和无甘油冻干PCR试剂冻融10次前后的性能。
[0025]性能验证涉及到的引物序列来源于CDC官方网站如下：
[0026]表1
[0027]N
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RCAGACATTTTGCTCTCAAGCTGN
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FGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATORF1ab
‑
FCCCTGTGGGTTTTACACTTAAORF1ab
‑
RACGATTGTGCATCAGCTGAN
‑
PVIC
‑
TTGCTGCTGCTTGACAGATT
‑
BHQ1ORF1ab
‑
PFAM
‑
CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG
‑
BHQ1
[0028]性能验证涉及到的体系配置如下：
[0029]表2
[0030][0031][0032]性能验证涉及到的扩增程序如下：
[0033]表3
[0034][0035]验证的结果如图1所示，本专利技术的无甘油冻干PCR试剂能够在
‑
20℃反复冻融10次前后性能无显著变化，而不含12X冻干保护剂的无甘油试剂储存于
‑
20℃，冻融5次后，性能即发生显著下降，甚至丧失扩增能力。
[0036]2、热加速稳定性
[0037]将对照试剂即不含12X冻干保护剂的试剂和无甘油冻干PCR试剂两组放在37℃金属浴条件分别处理3天、和7天，按照反复冻融案例中的性能验证方法，测试不含12X冻干保护剂的试剂和无甘油冻干PCR试剂热加速前后的性能，如图2所示，只有无甘油冻干PCR试剂能够在热加速7天前后性能无显著变化，而不含12X冻干保护剂的无甘油试剂37℃金属浴条件处理3天，性能即发生显著下降，甚至丧失扩增能力。
[0038]实施例2:本专利技术提供的无甘油冻干PCR试剂冻干前后性能验证。
[0039]本实施例中，液体的无甘油冻干PCR试剂，相比于普通的无甘油酶核酸扩增试剂液体性能验证方法同反复冻融案例中的性能验证方法，得到的结果如图3所示，无甘油冻干PCR试剂性能和普通的无甘油试剂性能一致。
[0040]无甘油冻干PCR试剂可经过如下冻干程序冻干：
[0041][0042][0043]酶mix中包含12X的冻干保护剂混合液，其终浓度为：甘露醇0.75mM,海藻糖0.3mM，明胶质量浓度0.003％，PEG6000 0.6mM，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)质量浓度0.006％，聚
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r谷氨
酸质量浓度0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于冻干的无甘油PCR试剂，其特征在于：包括4X缓冲液和无甘油酶混合物，所述4X缓冲液包含40mM Tris
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H2SO4，20mM KCl,1.5mM MgCl2，0.35mM dNTP mix，0.16mg/mL BSA；所述无甘油酶混合物包含：0.4U/μL
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1U/μL逆转录酶，0.2U/μL
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0.4U/μL RNAase抑制剂，0.14U/μL
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0.2U/μL DNA聚合酶逆转录酶和12X冻干保护剂；所述12X冻干保护剂，占无甘油PCR试剂终体积的1/12，冻干保护剂在无甘油PCR试剂中的终浓度为：甘露醇0.75mM,海藻糖0.3mM，明胶质量浓度0.003％，PEG6000 0.6mM，PVP质量浓度0.006...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，马海玲，何宗会，孙晓亮，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：