基因工程化的酵母细胞及其使用方法技术

本文提供了重组表达编码突变体β

Genetically engineered yeast cells and their application methods

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因工程化的酵母细胞及其使用方法
相关申请本申请根据35 U.S.C.
§
119(e)要求于2019年10月17日提交的美国临时申请号62/916,529，和于2020年10月1日提交的美国临时申请号63/086,363的权益。这些引用的申请的每一个的全部内容通过引用并入本文。政府支持本专利技术是在国家科学基金会授予的编号1831242奖项的政府支持下进行的。政府享有本专利技术的某些权利。


在过去的十年中，热带水果风味在美国和国际上的饮料市场上都变得越来越流行。参见Cannon等,J.Food Drug Anal.(2018)26:445
‑
468；Watson,B.Early 2018Beer Style Trends；Hahn等,Washington Post(2016):washingtonpost.com/lifestyle/food/pineapple
‑
and
‑
mango
‑
in
‑
the
‑
pint
‑
glass
‑
so
‑
hot
‑
right
‑
now/2016/05/22/73f6c52a
‑
1dd2
‑
11e6
‑
b6e0
‑
c53b7ef63b45_story.html。在啤酒行业，这种趋势通过其热带水果香气而有价值的调味啤酒花的使用急剧增加来举例证明。在葡萄酒行业中，热带风味基本香型(note)推动了白苏维浓(Sauvignon Blanc)和夏顿埃酒(Chardonnay)风格的流行，并且长期努力寻求进一步增加这些葡萄酒中的热带香气。参见Tominaga等,Flavour and Fragrance Journal(1998)13,159
–
162；Swiegers等,Yeast(2007)24,561
–
574；Howell等,Appl.Environ.Microbiol.(2005)71,5420
–
5426；Santiago等,FEMS Yeast Res.(2015)15,fov034；Roland,A.等,Flavour and Fragrance Journal(2012)27,266
–
272；Jeffery等，Australian Journal of Chemistry(2016)69,1323。研究显示，多种不同的风味分子组合产生了大部分的水果风味。参见Cannon等,J.Food Drug Anal.(2018)26:445
‑
468；Bartowsky等,Biology of Microorganisms on Grapes,in Must and in Wine,pp:209
–
231；Holt等,(FEMS Microbiol.Rev.2019)43:193
‑
222。然而，许多研究也将白苏维浓葡萄酒的大部分热带风味和香气归因于存在三种特定的挥发性硫醇(thiol)分子并且某些种类的调味啤酒花是由于存在三种特定的挥发性硫醇分子。这些硫醇，3
‑
巯基己
‑1‑
醇(3MH)、3
‑
巯基乙酸己酯(3MHA)和4
‑
甲基
‑4‑
巯基戊
‑2‑
酮(4MMP)在非常低的浓度下都可被人气味受体检测到，并且分别赋予葡萄柚/百香果、番石榴/醋栗和百香果/黑醋栗风味。参见Vanzo等,Sci.Rep.(2017):7；Roland等,Chem.Rev.(2012)111,7355
–
7376。

技术实现思路

本公开的方面提供了基因修饰的酵母细胞(修饰的细胞)，其包括编码具有β
‑
裂合酶活性的酶的异源基因。在一些实施方式中，具有β
‑
裂合酶活性的酶具有与SEQ ID NO:2陈述的序列至少90％序列同一性的序列。在一些实施方式中，具有β
‑
裂合酶活性的酶不包括SEQ ID NO:1、6或7陈述的序列。在一些实施方式中，具有β
‑
裂合酶活性的酶具有SEQ ID NO:2陈述的序列。在一些实施方式中，具有β
‑
裂合酶活性的酶具有与SEQ ID NO:3
‑
7的任一
个陈述的序列至少90％序列同一性的序列。在一些实施方式中，具有β
‑
裂合酶活性的酶具有SEQ ID NO:3
‑
5的任一个陈述的序列。在一些实施方式中，具有β
‑
裂合酶活性的酶包括对应于SEQ ID NO:1的位置H463的位置处的取代突变。在一些实施方式中，对应于SEQ ID NO:1的位置H463的位置处的取代突变是苯丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。在一些实施方式中，酵母细胞是属酵母菌属(Saccharomyces)。在一些实施方式中，酵母细胞是物种酿酒酵母(S.cerevisiae)。在一些实施方式中，酵母细胞是酿酒酵母California Ale酵母菌株WLP001。在一些实施方式中，酵母细胞是物种巴斯德酵母(S.pastorianus)。本公开的方面提供了产生发酵产物的方法，其包括，使本文所述的任何修饰的细胞与包括至少一种可发酵的糖的培养基接触，其中在至少第一发酵工艺期间进行接触，以产生发酵产物。在一些实施方式中，在至少一种糖源中提供了至少一种可发酵的糖。在一些实施方式中，可发酵的糖是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和/或麦芽三糖。在一些实施方式中，至少一种糖源包括至少一种前体，比如植物衍生的前体或化学合成的前体。在一些实施方式中，至少一种前体包括半胱氨酸缀合的3
‑
巯基己
‑1‑
醇(Cys 3
‑
MH)、半胱氨酸缀合的4
‑
甲基
‑4‑
巯基戊
‑2‑
酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽缀合的3
‑
巯基己
‑1‑
醇(Glut
‑3‑
MH)和/或谷胱甘肽缀合的4
‑
甲基
‑4‑
巯基戊烷2
‑
酮(Glut 4MMP)。在一些实施方式中，方法进一步包括将一种或多种前体添加至培养基，其中前体包括3
‑
巯基己烷
‑1‑
醇(Cys 3
‑
MH)，半胱氨酸
‑
缀合的4
‑
甲基
‑4‑
巯基戊烷
‑2‑
酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽缀合的3
‑
巯基己烷
‑1‑
醇(Glut
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种基因修饰的酵母细胞(修饰的细胞)，其包括编码具有β
‑
裂合酶活性的酶的异源基因。2.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述具有β
‑
裂合酶活性的酶具有与SEQ ID NO:2陈述的序列至少90％序列同一性的序列。3.根据权利要求1或2所述的修饰的细胞，其中所述具有β
‑
裂合酶活性的酶不包括SEQ ID NO:1、6或7陈述的序列。4.根据权利要求1
‑
3的任一项所述的修饰的细胞，其中所述具有β
‑
裂合酶活性的酶具有SEQ ID NO:2陈述的序列。5.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述具有β
‑
裂合酶活性的酶具有与S EQ ID NO:4或5的任一个陈述的序列至少90％序列同一性的序列。6.根据权利要求1或5所述的修饰的细胞，其中所述具有β
‑
裂合酶活性的酶具有SEQ ID NO:4
‑
7的任一个陈述的序列。7.根据权利要求1
‑
6的任一项所述的修饰的细胞，其中所述具有β
‑
裂合酶活性的酶包括对应于SEQ ID NO:1的位置H463的位置处的取代突变。8.根据权利要求7所述的修饰的细胞，其中对应于SEQ ID NO:1的位置H463的位置处的取代突变是苯丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。9.根据权利要求1
‑
8的任一项所述的修饰的细胞，其中酵母细胞是酵母菌属。10.根据权利要求9所述的修饰的细胞，其中酵母细胞具有物种酿酒酵母。11.根据权利要求10所述的修饰的细胞，其中酵母细胞是酿酒酵母加利福尼亚艾尔酵母菌株WLP001或红星白丘。12.根据权利要求9所述的修饰的细胞，其中酵母细胞是物种巴斯德酵母。13.一种产生发酵产物的方法，其包括，使权利要求1
‑
12的任一项所述的修饰的细胞与包括至少一种可发酵的糖的培养基接触，其中在至少第一发酵工艺期间进行接触，以产生发酵产物。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种可发酵的糖在至少一种糖源中提供。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中可发酵的糖是葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和/或麦芽三糖。16.根据权利要求13
‑
15的任一项所述的方法，其中至少一种糖源包括至少一种前体。17.根据权利要求16所述的方法，其中至少一种前体包括半胱氨酸缀合的3
‑
巯基己
‑1‑
醇(Cys 3
‑
MH)、半胱氨酸
‑
缀合的4
‑
甲基
‑4‑
巯基戊
‑2‑
酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽缀合的3
‑
巯基己
‑1‑
醇(Glut
‑3‑
MH)和/或谷胱甘肽缀合的4
‑
甲基
‑4‑
巯基戊2
‑
酮(Glut 4MMP)。18.根据权利要求13
‑
17的任一项所述的方法，其进一步包括将一种或多种前体添加到培养基中，其中所述前体包括3
‑
巯基己
‑1‑
醇(Cys 3
‑
MH)、半胱氨酸
‑
缀合的4
‑
甲基
‑4‑
巯基戊
‑2‑
酮(Cys 4MMP)、谷胱甘肽缀合的3
‑
巯基己
‑1‑
醇(Glut
‑3‑
MH)和/或谷胱甘肽缀合的4
‑
甲基
‑4‑
巯基戊2
‑
酮(Glut 4MMP)。19.根据权利要求9
‑
18的任一项所述的方法，其中与由不表达异源基因的对应细胞或表达具有β
‑
裂合酶活性的野生型酶的对应细胞产生的发酵产物相比，发酵产物包括增加水平的至少一种挥发性巯基。
20.根据权利要求19所述的方法，其中至少一种挥发性巯基包括3
‑
巯基己
‑1‑
醇(3MH)、3
‑
巯基乙酸己酯(3MHA)、4
‑
甲基
‑4‑
巯基戊
‑2‑
酮(4MMP)或其组合。21.根据权利要求20所述的方法，其中发酵产物包括至少200ng/L 3
‑
巯基己
‑1‑
醇(3MH)、3
‑
巯基乙酸己酯(3MHA)和/或4
‑
甲基
‑4‑
巯基戊
‑2‑
酮(4MMP)。22.根据权利要求13
‑
21的任一项所述的方法，其中与由不表达异源基因的对应细胞或表达具有β
‑
裂合酶活性的野生型酶的对应细胞产生的发酵产物相比，发酵产物包括降低水平的至少一种不希望的产物。23.根据权利要求22所述的方法，其中至少一种不希望的产物是吲哚。24.根据权利要求13
‑
23的任一项所述的方法，其中所述发酵产物是发酵饮料。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述发酵饮料是啤酒、葡萄酒、起泡酒(香槟)、清酒、蜂蜜酒、康普茶或苹果酒。26.根据权利要求13
‑
25的任一项所述的方法，其中所述糖源包括麦芽汁、水果果汁、蜂蜜、大米淀粉或其组合。27.根据权利要求26所述的方法，其中水果果汁是葡萄果汁或苹果果汁。28.根据权利要求13
‑
27的任一项所述的方法，其中所述糖源是麦芽汁并且所述方法进一步包括产生培养基，其中产生培养基包括：(a)使多种谷物与水接触；和(b)煮沸或浸泡水和谷物以产生麦芽汁。29.根据权利要求28所述的方法，进一步包括将至少一种啤酒花种类添加到麦芽汁中以产生加了啤酒花的麦芽汁。30.根据权利要求13
‑
29的任一项所述的方法，进一步包括将至少...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：伯克利发酵科学公司，
类型：发明
国别省市：