用于检测肺结核的血清代谢标志物及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一组用于检测肺结核的血清代谢标志物及其试剂盒，所述血清代谢标志物共17种，经验证后所述17种代谢物的水平变化确实与肺结核相关。基于上述17种代谢标志物水平的肺结核检测模型在肺结核检测中ROC曲线下的面积可达到99.5％，敏感性98.2％，特异性95.8％。本发明专利技术还提供一种肺结核检测试剂盒，包括上述的17种肺结核病人血清中的代谢物的检测试剂，所述检测试剂用于对所述17种肺结核病人血清中的代谢物进行定量检测。本发明专利技术的用于检测肺结核的血清代谢标志物以及试剂盒能够帮助医生准确的进行疾病诊断，对于肺结核的诊断和治疗具有重要意义。疗具有重要意义。疗具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
用于检测肺结核的血清代谢标志物及其试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测肺结核的血清代谢标志物及其试剂盒。

技术介绍

[0002]肺结核病的检测以病原学检测为金标准，由于涉及大量活菌操作，耗时较长，而且对技术人员操作熟练程度及实验室生物安全级别要求较高，在经济欠发达地区受到限制，不利于结核病的早期控制。血清学也可用于结核检测，而且检测操作简单，但是现有的检测方法的敏感性与特异性均有待提高。
[0003]近几年发展起来的分子生物学检测技术如聚合酶链反应(PCR)、DNA探针技术、DNA序列测定、基因芯片技术等因操作要求较高、价格昂贵等问题使其使用受到限制。准确、敏感、特异、方便、快速的早期鉴别与检测对控制病菌感染、减少传播机会、抑制结核流行具有非常重要的意义。
[0004]代谢组学揭示的小分子代谢变化是一系列生命活动的终端，直接反映生命活动的最终状态。疾病发展过程的各个阶段病理生理的变化都可由代谢变化反映出来，代谢组学可以根据这些变化筛选出相关的生物标志物，还可以在疾病早期就检测到代谢物含量的改变，借以揭示疾病发生发展过程中的代谢变化机制，为进一步探索疾病治疗靶点提供有用的信息。肺结核引起的系统性变化不仅反映在结核杆菌感染的部位，全身代谢也发生了变化。因此使用代谢组方法寻找结核的标志物具有重要的临床价值。
[0005]目前，代谢组学已经用于结核研究。有研究者使用液相色谱质谱联用技术(LC
‑
MS)分析血清、尿液、痰液样本，利用统计学方法如主成分分析法(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS
‑
DA)对质谱数据进行分析，寻找结核的生物标志物。但这些研究大多仅针对小量样本，实际临床意义十分有限。

技术实现思路

[0006]针对肺结核现缺少能准确鉴别诊断肺结核的血清标志物，本专利技术提供了一组用于检测肺结核的血清代谢标志物及其试剂盒。所述血清代谢标志物可有效克服现有技术在肺结核检测方面的缺陷及不足，能够提高肺结核检测的准确率。
[0007]本专利技术采用以下技术方案实现：
[0008]一组用于检测肺结核的血清代谢标志物，所述标志物为在肺结核患者血清中的代谢物(17种)，见表1。
[0009]本专利技术的代谢标志物对于肺结核具有较高的灵敏性和特异性，对于结核治疗具有重要意义。
[0010]本专利技术的用于检测肺结核的血清代谢标志物的筛选方法，包括以下步骤：
[0011](1)于空腹状态下用BD黄色5.0ml 367955SST II血清分离胶管采血管采集结核病患者以及健康人的血(静脉)1
‑
2ml；
[0012](2)在采集后的两小时内，将血液于4℃，3500rpm离心10min；
[0013](3)分离上层血清0.3mL到1.5mL于新的EP管中，保存于
‑
80℃冰箱；
[0014](4)在LDI MS实验中，铁颗粒以1mg mL
‑
1的浓度分散在水中作为基质。将稀释10倍的血清1μL直接点于抛光板上，室温空气干燥，然后加入基质浆液1μL，干燥后进行LDI MS分析。
[0015](5)采用LDI MS技术对每个分析样本进行分析，得到各血清样本的原始代谢指纹图谱；质谱记录在AutoFlex TOF/TOF质谱仪(Bruker,Germany)上。
[0016](6)利用MATLAB(R2016a,the MathWorks,USA)对原始质谱数据进行基线校正、峰值检测、提取、比对、归一化、标准化等预处理，将从仪器中获得的原始数据转换为可用于进一步统计分析的数据形式。
[0017](7)使用机器学习偏最小二乘法(Partial Least Squares，PLS)算法学习步骤(6)的数据，随机将上述结核及健康血清样本数据的3/4作为训练集，1/4作为测试集进行学习。
[0018](8)应用偏最小二乘法PLS建立检测模型，绘制ROC曲线。
[0019](9)应用MetaboAnalyst 5.0软件进行差异分析和富集分析。
[0020](10)根据模型选出频率大于90％，p值小于0.05，VIP值大于1的作为差异代谢物。
[0021](11)将差异数据与人类代谢组数据库(HMDB)中的谱图信息进行比对，从而对代谢物进行鉴定，即可得到上述17种血清代谢标志物。
[0022]基于筛选出的17种血清代谢标志物，使用机器学习偏最小二乘法(Partial Least Squares，PLS)算法建立肺结核检测模型。将需检测的患者血液经步骤(1)
‑
(6)所述方法处理，并将步骤(6)所得数据输入所建立的肺结核检测模型中，即可检测出患者是否患有肺结核。
[0023]本专利技术还提供一种肺结核检测试剂盒，包括上述的17种肺结核病人血清中的代谢物的检测试剂，所述检测试剂用于对所述17种肺结核病人血清中的代谢物进行定量检测。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0025]本专利技术首次发现上述17种代谢标志物的水平变化与肺结核相关，采用代谢组学分析发现检测肺结核病人血清中17种代谢物的水平异常。基于所述17种代谢标志物水平，结合代谢组学分析以及机器学习方法，构建肺结核检测模型，并使用受试者工作曲线(ROC)评价其检测肺结核的效能。基于上述17种代谢标志物水平的肺结核检测模型在肺结核检测中ROC曲线下的面积可达到99.5％，敏感性98.2％，特异性95.8％。
[0026]本专利技术采用血清代谢组学技术以及机器学习方法得到适合于肺结核的检测标志物和肺结核检测模型。本专利技术的肺结核检测模型效果良好，灵敏度高，特异性好，适合于肺结核的检测。本专利技术仅通过取血检测就能实现肺结核的诊断，检测速度快，且样本仅需50nL，有利于肺结核的早诊早治，具有很好的临床使用和推广价值。
附图说明
[0027]图1是原始代谢指纹图谱的质谱图。
[0028]图2是使用17种血清代谢标志物构建的肺结核检测模型的分类性能图。
具体实施方式
[0029]下面结合具体实施实例，进一步阐释本专利技术，本专利技术的实施例仅用于解释本专利技术，并不意味着限制本专利技术的保护范围。
[0030]1、研究对象
[0031]本研究共包含来自于浙江省杭州市红十字会医院118例健康人血清样本以及110例结核样本。其中结核检测标准是经菌培养，涂片，影像学检测，分子检测等综合检测结果判定。
[0032]2、血液样本预处理
[0033](1)静脉抽血1
‑
2mL(避免血清溶脂，溶血)，注入真空采血管，立刻上下颠倒混匀5
‑
8次，使附着在管壁上的促凝剂能够充分混合于血液中。
[0034](2)在室温(20℃
‑
25℃)下，静置约30min，等血液完全凝固。
[0035](3)待血清充分析出后，在离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测肺结核的血清代谢标志物，其特征在于，包括17种肺结核病人血清中的代谢物，具体为：D
‑
Leucic acid、Leucinic acid、L
‑
Cystine、MG(0:0/14:0/0:0)、S
‑
Lactoylglutathione、Octacosanoic acid、Cer(d18:1/12:0)、Raffinose、LysoPC(20:1(11Z)/0:0)、LysoPC(22:4(7Z,10Z,13...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄品同，刘亚静，苏艳，张超，
申请(专利权)人：浙江苏可安药业有限公司，
类型：发明
国别省市：