一种快速杂交捕获试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种快速杂交捕获试剂盒，通过改进试剂盒的组分，简化了试剂盒的实验流程，且通过对杂交方式的改进，使杂交捕获时间大大缩短；同时采用优化洗液2和洗液3的配方，有效改善了链霉亲和素磁珠粘壁现象，减少了链霉亲和素磁珠清洗过程中因粘壁而造成的损失，提高了捕获文库的浓度，并有效改善了杂交捕获效率和文库的均一性；此外试剂盒组分中稳定剂和保护剂的添加，使试剂盒可以长期室温稳定保存，使用方便。使用方便。使用方便。

【技术实现步骤摘要】
一种快速杂交捕获试剂盒


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种快速杂交捕获试剂盒。

技术介绍

[0002]高通量测序技术(NGS)凭借其高通量、精确度高和信息量丰富等优势，在基础研究、产前诊断、遗传病诊断、肿瘤诊断与精准医疗等领域应用广泛。然而，进行全基因组测序不仅耗费时间和精力，还会产生很多冗余且无临床价值的数据，因此捕获特定区域进行检测是目前临床应用的主流处理方案。
[0003]与全基因组测序相比，靶向杂交捕获测序可对特定区域进行分离和富集，不仅检测灵敏度高，而且大大降低后续数据分析工作。因此，高效的捕获试剂盒至关重要。
[0004]目前市场上有多种杂交捕获试剂盒，其基本流程类似，以IDT公司的xGen Hybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒为例。该试剂盒的组分主要包括：Human Cot DNA、2x Hybridization Buffer、Hybridazation Buffer Enhancer、2xBeads Wash Buffer、10xWash Buffer I、10xWash Buffer II、10xWash Buffer III、10xStringent Wash Buffer、链霉亲和素磁珠M
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270，还需要另外购买AMPure XP beads(Beckman公司)、IDTE(IDT公司)、Universal Blockers
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TS Mix(IDT公司)、KAPA HiFi Hotstart Readymix(Roche公司)、Library Amplification Primer P5+P7(Life公司合成)、捕获探针(IDT公司定制)、Nuclease
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free water(无核酸酶水，简称NFW，Life公司)等试剂。
[0005]上述现有的杂交捕获试剂盒组分较多，且需要现配现用，操作较繁琐，同时杂交时间长达16～72小时。此外，链霉亲和素磁珠经过65℃热洗之后，磁珠变得干燥，再使用洗液清洗时，磁珠粘壁现象严重，导致磁珠损失，进而使捕获效率和捕获文库均一性均有所降低，因此，目前市面上急缺杂交时间短且捕获性能好的试剂盒。

技术实现思路

[0006]为解决现有技术的不足，本专利技术提出一种快速杂交捕获试剂盒。
[0007]为实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案包括：
[0008]一种杂交反应液，其特征在于，所述杂交反应液包括：海藻糖、吐温和甘油。
[0009]进一步地，所述杂交反应液还包括xGen Hybridization Buffer Enhancer、xGen2X Hybridization Buffer、捕获探针和NFW。
[0010]进一步地，所述杂交反应液中，所述xGen Hybridization Buffer Enhancer的体积百分比为10～20％、所述xGen 2X Hybridization Buffer的体积百分比为40～60％、所述捕获探针的体积百分比为8～16％、所述海藻糖的质量百分比为1～20％、所述吐温的体积百分比为0.1～0.5％、所述甘油的体积百分比为5～30％、所述NFW的体积百分比为2～10％。
[0011]进一步地，所述杂交反应液中，所述xGen Hybridization Buffer Enhancer、所述xGen 2X Hybridization Buffer、所述捕获探针、所述吐温、所述甘油、和所述NFW的体积配
Amplification Primer P5+P7和NFW。
[0034]进一步地，所述试剂盒还包括一种磁珠重悬液，所述磁珠重悬液包括：xGen Hybridization Buffer Enhancer、xGen 2X Hybridization Buffer、吐温、甘油、NFW。
[0035]进一步地，所述磁珠重悬液中，所述xGen Hybridization Buffer Enhancer的体积百分比为10～20％、所述xGen 2X Hybridization Buffer的体积百分比为40～60％、所述NFW的体积百分比为18～28％、所述甘油的体积百分比为5～30％、所述吐温的体积百分比为0.1～0.5％。
[0036]进一步地，所述磁珠重悬液中，所述xGen Hybridization Buffer Enhancer、所述xGen 2X Hybridization Buffer、所述NFW、所述甘油和所述吐温的体积配比优选为270:850:375:200:5。
[0037]本专利技术还涉及一种采用如上所述的试剂盒捕获文库方法包括以下步骤：
[0038]S1、文库封闭与浓缩；
[0039]S2、文库杂交；
[0040]S3、洗涤富集。
[0041]进一步地，所述步骤S1包括在待捕获文库中加入所述封闭液，混匀后用真空浓缩仪抽干。
[0042]进一步地，所述步骤S2包括将所述杂交反应液加入到抽干管中，混匀后静置10min，置于PCR仪上进行杂交反应。
[0043]进一步地，所述杂交反应包括：
[0044]在95℃条件下，反应5min，循环一次；
[0045]在95℃条件下，反应1min，循环30次，每个循环温度降低1℃；
[0046]在65℃条件下，反应30min，循环一次；
[0047]在65℃条件下，保温反应，循环一次。
[0048]进一步地，所述步骤S3包括以下子步骤：
[0049]S31、采用所述磁珠清洗液清洗链霉亲和素磁珠；
[0050]S32、采用所述磁珠重悬液重悬所述磁珠，并将所述重悬磁珠置于所述步骤S2杂交反应后得到的杂交液中孵育；
[0051]S33、分别采用所述洗液1、所述增强洗液、所述洗液2、所述洗液3清洗所述磁珠；
[0052]S34、采用所述PCR引物混合液重悬所述磁珠，并进行PCR反应；
[0053]S35、将所述PCR产物进行纯化，对捕获文库进行分析。
[0054]本专利技术的有益效果为：
[0055]采用本专利技术所述一种快速杂交捕获试剂盒，通过改进试剂盒的组分，简化了试剂盒的实验流程，且通过对杂交方式的改进，使杂交捕获时间缩短了约14h；同时采用优化的洗液2和洗液3的配方，有效改善了链霉亲和素磁珠粘壁现象，减少了链霉亲和素磁珠清洗过程中因粘壁而造成的损失，提高了捕获文库的浓度，并有效改善了杂交捕获效率和文库的均一性；此外试剂盒组分中稳定剂和保护剂的添加，使试剂盒可以长期室温稳定保存，使用方便。
P5+P7(Life公司合成)、Probe(IDT公司定制)、Nuclease
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free water(简称NFW，Life公司)。
[0072]其捕获文库流程如下：
[0073]1.文库封闭与浓缩
[0074]在400ng待本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杂交反应液，其特征在于，所述杂交反应液包括：海藻糖、吐温和甘油。2.如权利要求1所述的杂交反应液，其特征在于，所述杂交反应液还包括xGen Hybridization Buffer Enhancer、xGen 2X Hybridization Buffer、捕获探针和NFW。3.如权利要求2所述的杂交反应液，其特征在于，所述杂交反应液中，所述xGen Hybridization Buffer Enhancer的体积百分比为10～20％、所述xGen 2X Hybridization Buffer的体积百分比为40～60％、所述捕获探针的体积百分比为8～16％、所述海藻糖的质量百分比为1～20％、所述吐温的体积百分比为0.1～0.5％、所述甘油的体积百分比为5～30％、所述NFW的体积百分比为2～10％。4.一种工作清洗液组合，其特征在于，所述清洗液组合包括洗液2和洗液3，且所述洗液2和洗液3其中至少一种包括吐温。5.如权利要求4所述的清洗液组合，其特征在于，所述清洗液组合还包括磁珠清洗液、洗液1和增强洗液。6.如权利要求5所述的清洗液组合，其特征在于，所述洗液2还包括xGen10X wash buffer II、NFW。7.如权利要求6所述的清洗液组合，其特征在于，所述洗液2中，所述xGen10X wash buffer II的体积百分比为5～15％、所述NFW的体积百分比为85～95％、所述吐温的体积百分比为0.1～0.5％。8.如权利要求4至7任一项所述的清洗液组合，其特征在于，所述洗液3还包括xGen 10X wash buffer III、NFW。9.如权利要求8所述的清洗液组合，其特征在于，所述洗液3中，所述xGen10X wash buffer III的体积百分比为5～15％、所述NFW的体积百分比为85～95％、所述吐温的体积百分比为0.1～0.5％。10.一种快速杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1至3任一项所述的杂交反应液和/或如权利要求4至9任一项所述的清洗液组合。11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括一种封闭液，所述封闭液包括Human Cot DNA、Universal Blockers
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TS Mix、甘油。12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液中，所述Human Cot DNA的体积百分比为4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张华，秦资，祝君，李芳敏，袁庆明，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：