信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株及其制备方法和应用。具体为应用反向遗传操作技术，对信鸽新城疫病毒株(PNDV

Carrier pigeon Newcastle disease virus genetically engineered attenuated strain and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及禽类病毒基因工程研究及疫苗制备
，具体为一种信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]鸽新城疫(Pigeon Newcastle disease,PND)又称鸽瘟，是威胁信鸽产业健康发展的头号疫病。80年代初首先在非洲流行，然后传至欧美等国家，1986年前后传至我国。该病传播迅速，不同品种和日龄的鸽均易感，发病率高达50％～80％，发病初期病鸽精神沉郁、羽毛蓬乱、闭目缩颈；随着病程的发展，病鸽出现腿麻痹、扭头歪颈、翅膀下垂、转圈等神经症状；发病后期病鸽卧地不起、食欲废绝，最终衰竭而死。成年鸽感染耐过后，常有神经性后遗症，严重影响信鸽的飞翔能力和生产性能，给信鸽产业造成了重大的经济损失。
[0003]根据病毒基因组长度、F基因和L基因序列，新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV) 可分为两大分支：ClassⅠ、ClassⅡ，ClassⅡ目前发现有9个基因型(基因Ⅰ型～
Ⅸ
型)。1978 年～2002年，16个国家的鸽源新城疫病毒分离株基因型多数为
Ⅵ
b亚型，国内鸽源新城疫毒株均为基因
Ⅵ
b亚型。根据测定NDV毒力的鸡脑内致病指数(ICPI)和鸡静脉接种致病指数 (IVPI)，可将NDV分为强毒株、中强毒力毒株和弱毒株。ICPI划分标准为>1.75、1.2～1.75 和<1.2；IVPI划分标准为>2.70、1.45～0.00和0.00。信鸽源新城疫病毒株毒力属于中强毒力毒株。
[0004]疫苗免疫接种是预防本病最有效的手段。考虑生物安全，疫苗生产使用的毒种，OIE规定禁止使用毒力强的毒种来制备新城疫疫苗(灭活疫苗生产毒种的ICPI应不超过0.7，活疫苗生产毒种ICPI应不超过0.4)。由于鸽源分离毒株均为强毒株，所以国内外利用鸡源NDV LaSota株(基因Ⅱ型)制备的灭活疫苗进行免疫。但因存在基因型和抗原性上的差异，La Sota 株制备的疫苗免疫鸽群中仍发生
Ⅵ
b亚型NDV的感染与流行，表明当前疫苗株并不能有效预防
Ⅵ
b亚型NDV的感染。此外部分鸽场还使用鸡新城疫活疫苗，但活疫苗对鸽有致病性，如La Sota毒株或Clone30毒株免疫鸽后，部分鸽会发生采食量下降、精神沉郁、拉绿色稀便和后期转脖等神经症状。因此，应该使用毒力弱、遗传稳定和免疫原性好的鸽源新城疫病毒株(PNDV)制备疫苗来预防鸽新城疫。目前国内外还未见有信鸽专用的新城疫疫苗， CN201610361716.3公开了一种鸽1型副黏病毒毒株AF
‑
1及其应用，该毒株为鸽1型副黏病毒 AF
‑
1，CCTCC NO：V 201613，首先培养鸽1型副黏病毒毒株AF
‑
1，得到AF
‑
1株病毒液，向AF
‑
1株病毒液中加入β
‑
丙内酯；灭活得到混合液；再加入吐温
‑
80得到水相溶液；向白油中加入硬脂酸铝，边加边搅拌直到完全透明为止，再加入吐温
‑
80得到油相溶液；向油相溶液中缓缓加入水相溶液置于乳化罐内进行乳化；得到灭活疫苗。OIE禁止使用强毒力毒株来制备新城疫疫苗，将鸽源分离毒株直接用于疫苗的制备，存在较大的安全隐患。 CN201210240399.1公开了一种基因
Ⅵ
b亚型新城疫病毒致弱株
Ⅵ
bI4及其构建方法，该专利技术应用反向遗传技术，利用含有鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi基因组全长的转录载体pTVT/071204，对其F基因进行致突变后获得转录载体ApTVT/071204，再将新城疫病毒rNDV/I4的
NP、P和 L基因片段替换ApTVT/071204上的对应部分，得到重组质粒ApTVT/
Ⅵ
bI4，该质粒与辅助质粒共转染BSR
‑
T7/5细胞后成功拯救出重组病毒
Ⅵ
bI4，接种鸡胚用于制造疫苗。该专利主要内容为载体构建方法，未叙述具体细节，研究内容偏少，且利用构建毒种制备疫苗的方法未在专利中详述。制备工艺未针对使用对象鸽进行优化，具体使用鸽种类不明确，胸部肌肉注射接种途径不适用于信鸽(信鸽灭活疫苗接种仅能采用颈部皮下接种)。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的问题，本专利技术目的之一是提供一种信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒及其构建方法，该目的是通过以下技术方案实现的：
[0006]为了实现本专利技术目的，采用以下的技术方案：
[0007]本专利技术将基因VIb亚型信鸽源新城疫病毒YQ株(简称PNDV
‑
YQ株)，经过反向遗传技术突变F基因3个关键毒力裂解位点氨基酸，获得的毒力致弱株，命名为鸽新城疫病毒aYQ株(简称PNDV
‑
aYQ株)，其基因组序列如SEQ ID NO：1所示，其F蛋白裂解位点为
‑
112GRQGRLI 118
‑
。所述PNDV
‑
aYQ株可以凝集鸡的红细胞，其HA效价为1:128～1:512，病毒含量为 10
‑
8.0
～10
‑
8.9
EID
50
/0.1ml；PNDV
‑
aYQ株1日龄鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)结果均为0，鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT)测定结果大于120h；以10
6.0
ELD
50
/羽的剂量人工感染鸽，未见异常症状。PNDV
‑
aYQ株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：24460，分类命名：鸽新城疫病毒，保藏日期：2022年03月28日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院院微生物研究所，邮编：100101。
[0008]所述PNDV
‑
aYQ株的构建方法为：
[0009]对基因VIb亚型鸽源新城疫病毒YQ株(简称PNDV
‑
YQ株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：24459，分类命名：鸽新城疫病毒，保藏日期：2022年03月28日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院院微生物研究所，邮编：100101)的F蛋白裂解位点的第112位、115位和117位氨基酸进行了定点突变，通过分段克隆的方式构建并获得低毒力基因的全长cDNA质粒 pOK
‑
aYQ；再分别将PNDV
‑
YQ株的NP、P和L的开放阅读框基因克隆至真核表达载体 pCIneo，构建并获得辅助质粒pCI
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：24460。2.一种信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株，其特征在于，其基因组序列如SEQ ID NO：1所示。3.根据权利要求1或2所述的信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株，其特征在于，其F蛋白裂解位点为
‑
112GRQGRLI 118
‑
。4.权利要求1或2所述信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株的构建方法，其特征在于：选择基因VIb亚型信鸽源新城疫病毒YQ株，简称PNDY
‑
YQ，作为改造病毒株，将PNDY
‑
YQ的F蛋白裂解位点的第112位、115位和117位氨基酸进行了定点突变，通过分段克隆的方式构建并获得低毒力基因的全长cDNA质粒pOK
‑
aYQ；再分别将PNDY
‑
YQ的NP、P和L的开放阅读框基因克隆至真核表达载体pCIneo，构建并获得辅助质粒pCI
‑
NP，pCI
‑
P，pCI
‑
L；全长cDNA质粒pOK
‑
aYQ与辅助质粒pCI
‑
NP，pCI
‑
P，pCI
‑
L共转染BSR
‑
T7细胞后，拯救出重组致弱病毒，命名为鸽新城疫病毒aYQ株，简称PNDY
‑
aYQ，即为所述信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：具体步骤为：1)将PNDY
‑
YQ株全长cDNA序列分成6段，分别扩增并连接在pMD18/19载体上；对F蛋白裂解位点的3个氨基酸R112G，K115G，F117L进行突变，并在片段1前加入T7启动子序列，在片段6尾端引入丁型肝炎核酶序列和T7终止子序列；随后依次将各片段克隆至T7的pOK12载体中，将构建的质粒命名为pOK
‑
aYQ；2)根据测定的PNDY
‑
YQ株全长基因组序列，将NP，P和L的开放阅读框分别克隆至真核表达载体pCIneo的CMV启动子下游，构建的辅助质粒分别命名为pCI
‑
NP，pCI
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志远，孙晔，林健，程水生，刘月焕，高洁，段会娟，潘雨，王楠，赵际成，黄程，刘立新，程慧敏，潘洁，
申请(专利权)人：北京中海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：