shRNA分子及其在敲低TM9SF2基因表达中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种shRNA分子及其在敲低TM9SF2基因表达中的应用。本发明专利技术通过分析TM9SF2基因序列，确定特异性shRNA的靶向序列并合成shRNA，利用慢病毒转导系统构建稳定表达shRNA的细胞系，并在mRNA和蛋白层面检测特异性shRNA的干扰效果，为深入研究TM9SF2在细胞生理或病理过程中的作用提供了细胞模型。胞生理或病理过程中的作用提供了细胞模型。

ShRNA molecule and its application in knockdown of tm9sf2 gene expression

【技术实现步骤摘要】
shRNA分子及其在敲低TM9SF2基因表达中的应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，特别是涉及一种shRNA分子及其在在敲低TM9SF2基因表达中的应用。

技术介绍

[0002]九次跨膜超家族蛋白(Transmembrane 9superfamily protein,TM9SF)又称为nonaspanins蛋白，是一组进化高度保守且包含9个跨膜结构域的蛋白。目前发现该家族蛋白在细菌、酵母、果蝇、哺乳动物等多个物种均有表达，其中人TM9SF家族包括4个成员即TM9SF1、TM9SF2、TM9SF3和TM9SF4，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现3个成员TMN1、TMN1和TMN3，果蝇体内发现TM9SF2、TM9SF3、TM9SF4三个成员。该类蛋白在人体组织和多种细胞系广泛表达，与细胞免疫、细胞黏附、吞噬、内质网应激、肿瘤发生及病原微生物感染与致病等多种生理或病理反应密切相关。目前，关于该蛋白家族的系统研究较少，且多数研究主要集中于模式生物如阿米巴变形虫细胞粘菌(Dictyosteliumdiscoideum)、果蝇(Drosophila)、斑马鱼(zebrafish)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大鼠(Rat)。
[0003]TM9SF2(Transmembrane 9Superfamily Member 2)又称p76跨膜蛋白，从酵母到植物和人类都具有高度保守的序列和结构，表明其在细胞生理功能方面发挥重要作用。人TM9SF2蛋白主要定位于细胞内体，可能扮演离子通道或小分子转运载体的角色。另外，近期一些研究发现，TM9SF2在某些病原微生物感染和致病过程中发挥重要作用，如痘苗病毒、基孔肯雅病毒、肠出血性大肠杆菌以及细菌毒素如志贺毒素和蓖麻毒素。而且，TM9SF2的单核苷酸多态性分析发现，其与获得性免疫缺陷综合征即艾滋病的病程存在某种相关性，但遗憾的是这种相关性仍然没有被揭示。CRISPR
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Cas9介导的全基因组筛选实验发现，TM9SF2是腺相关病毒(Adeno
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associated virus,AAV)基因转导的关键因子。
[0004]然而，目前缺乏一种显著敲低TM9SF2的细胞系以针对该类蛋白的功能及机制进行深入研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种可显著敲低TM9SF2基因表达的shRNA分子及其在敲低TM9SF2基因表达中的应用。
[0006]本专利技术提供了一种shRNA分子，所述shRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
[0007]本专利技术提供了一种DNA片段，所述DNA片段编码权利要求1所述的shRNA分子。
[0008]本专利技术提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有编码如上所述的shRNA分子的核苷酸序列。
[0009]在一些实施例中，所述重组表达载体为慢病毒载体。
[0010]在一些实施例中，所述重组表达载体基于psi
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LVRU6MH载体构建得到。
[0011]本专利技术提供了如上所述的shRNA分子、DNA片段或重组表达载体在敲低TM9SF2基因表达中的应用。
[0012]本专利技术提供了一种宿主细胞，其基因组中含有如上所述的DNA片段。
[0013]在一些实施例中，所述宿主细胞为A549细胞或293T细胞。
[0014]本专利技术提供了一种TM9SF2基因敲低细胞系的制备方法，包括以下步骤：在目的细胞中外源表达如上所述的shRNA分子。
[0015]本专利技术提供了如上所述的shRNA分子、DNA片段或重组表达载体在制备用于抑制病毒感染的产品中的应用，所述病毒为埃博拉病毒。
[0016]本专利技术通过TM9SF2基因序列分析，根据shRNA设计的原则确定靶向序列并合成shRNA，构建到含U6启动子的shRNA表达慢病毒载体pLVRU6H上并进行DNA测序鉴定；然后利用慢病毒包装系统制备携带shRNA的VSV
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G蛋白包裹的假型慢病毒，感染靶细胞48h时收集细胞总RNA，通过RT
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qPCR方法确定特异性shRNA的干扰效率；进而利用潮霉素压力多轮筛选获得细胞克隆，扩大培养后提取细胞总RNA和总蛋白，分别通过RT
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qPCR、Western blot进行鉴定。结果显示，其中靶向2个位点的TM9SF2 shRNA的干扰效果最好，筛选获得两株分别靶向TM9SF2不同位点的A549细胞系，其中1株在RNA和蛋白水平的敲低效果最好。本研究首次成功筛选获得TM9SF2稳定敲低的A549细胞系，且TM9SF2的敲低对A549细胞活性无显著影响，为其功能研究奠定了细胞基础。
附图说明
[0017]图1为本专利技术一实施例的qRT
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PCR和Western blot检测TM9SF2在细胞内固有表达情况；其中，A为qRT
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PCR检测293T、A549和THP
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1细胞内TM9SF2 mRNA的相对表达分析，以293T细胞作为参照，B为Western blot分析293T、A549和THP
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1细胞内TM9SF2蛋白的表达；
[0018]图2为本专利技术一实施例的TM9SF2 shRNA的设计与干扰表达效果分析；其中，A为TM9SF2 shRNA设计与靶向位点分析，B为qRT
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PCR检测shRNA靶向干扰A549内TM9SF2的转录水平；
[0019]图3为本专利技术一实施例的TM9SF2 shRNA稳定表达细胞系的鉴定；其中，A为PCR鉴定TM9SF2转录水平，B为qRT
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PCR检测shRNA靶向干扰A549内TM9SF2的转录水平，C为Western blot分析细胞内TM9SF2的敲低情况；
[0020]图4为本专利技术一实施例的A549
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TM9SF2KD细胞活性分析；
[0021]图5为本专利技术一实施例的含萤光素酶报告基因的EBOV GP包裹的VSV或HIV假型病毒感染A549
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TM9SF2KD细胞后48h细胞内萤光素酶活性检测结果；其中，A为EBOV GP包裹的VSV假型病毒，B为EBOV GP包裹的VSV或HIV假型病毒。
具体实施方式
[0022]为了更加简洁明了的展示本专利技术的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本专利技术做进一步的详细描述。可以理解，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用
进行改动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种shRNA分子，其特征在于，所述shRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。2.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段编码权利要求1所述的shRNA分子。3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有编码权利要求1所述的shRNA分子的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为慢病毒载体。5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体基于psi
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LVRU6MH载体构建得到。6.权利要求1所述的shRNA分子、权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜寿文，王宇航，李体远，吴诗品，许汪，
申请(专利权)人：深圳市人民医院，
类型：发明
国别省市：