AHNAK抑制EGFR-TKI药物在HCC中产生耐药性的应用制造技术

本发明专利技术公开了AHNAK抑制EGFR

Application of ahnak in inhibiting EGFR-TKI drug resistance in HCC

【技术实现步骤摘要】
AHNAK抑制EGFR
‑
TKI药物在HCC中产生耐药性的应用


[0001]本专利技术属于肝细胞癌
，具体涉及AHNAK抑制EGFR
‑
TKI药物在HCC中产生耐药性的应用。

技术介绍

[0002]肝细胞癌(HCC)是一种高死亡率的原发性肝癌，是全世界癌症相关死亡率的第三大常见原因，遗传、表观遗传改变、慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、黄曲霉毒素暴露、吸烟、肥胖和糖尿病等是肝癌的主要危险因素。癌细胞排列形成实性团块状，周围富有扩张的血窦。癌细胞境界不清，大小较一致，浆宽。核单个，类圆形，异形性不明显。
[0003]EGFR
‑
TKI耐药分原发性耐药和获得性耐药，原发性耐药是指使用EGFR
‑
TKI治疗后未见获益，继发性耐药是指接受EGFR
‑
TKI治疗后出现疗效(肿瘤缓解、进展延迟、症状改善等)而后又恶化，目前EGFR TKI出现获得性耐药的机制仍未完全明确。已有的研究显示，约50％的患者经过EGFR TKI治疗有效后出现的获得性耐药可能是由于肿瘤细胞出现了二次突变所致。另旁路激活途径也是机制之一，而一些肿瘤获得性耐药的分子机制目前仍不明。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供AHNAK抑制EGFR
‑
TKI药物在HCC中产生耐药性的应用。
[0005]抑制EGFR
‑
TKI药物在HCC中耐药性的靶标，其特征在于，所述靶标为AHNAK。
>[0006]所述EGFR
‑
TKI药物为阿法替尼、达克替尼、艾维替尼、奥西替尼中的一种或几种。
[0007]抑制AHNAK在体内表达的方法。
[0008]所述方法为基因敲除或RNAi抑制。
[0009]所述方法为抑制IGF
‑
1和EGF在体内表达。
[0010]本专利技术的有益效果：本专利技术发现AHNAK蛋白为激活HCC在EGFR
‑
TKI药物中的耐药性的关键物质，阻断AHNAK蛋白在体内的表达，可以降低HCC的耐药性，从而达到更好的肝癌治疗效果。本专利技术还研究了AHNAK蛋白参与IGF
‑
1R通路的活化的生化机制，为进一步筛选抗HCC耐药性的药物提供理论基础。
附图说明
[0011]图1为AHNAK蛋白在肝脏组织中的表达及分布；
[0012]图中，A为Western blot检测健康人、慢性肝炎、肝癌早期中的AHNAK蛋白表达；B为Western blot检测供肝组织、癌旁组织和癌组织的AHNAK蛋白表达；C为免疫组化检测供肝组织、癌旁组织和癌组织的AHNAK蛋白表达分布。
[0013]图2为AHNAK蛋白对HCC进展的促进作用；
[0014]图中，A为三个基因敲除细胞系中AHANK的表达；Mock，空质粒转染，KO1、KO2和KO3，AHNAK基因三个敲除位点的稳转细胞系(AHNAK
‑
/
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HepG2细胞)；B为AHNAK特异性敲除稳转HepG2细胞的增殖曲线；Normal，正常HepG2细胞；LV
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NC，空载体对照稳转HepG2细胞系；LV
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A：AHNAK
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/
‑
HepG2细胞。
[0015]图3为免疫共沉淀联合质谱及差异性通路聚类分析；
[0016]图中，A为通过AHNAK蛋白抗体分别在癌旁组织和癌组织中结合复合物，PAGE凝胶中分离；B为通过聚类分析AHNAK蛋白在癌旁组织和癌组织差异性通路。
[0017]图4为IGF
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1和EGF分别诱导AHNAK蛋白表达；
[0018]图中，A为HepG2细胞饥饿处理24h后，按照时间点加入IGF
‑
1，诱导出AHNAK的表达；B为HepG2细胞饥饿处理24h后，按照时间点加入EGF，诱导出AHNAK的表达。
[0019]图5为AHNAK蛋白与IGF
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1R存在相关作用；
[0020]图中，A为免疫荧光检测AHNAK蛋白和IGF
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1R亚细胞共定位；B为免疫共沉淀检测AHNAK蛋白和IGF
‑
1R相互作用。
[0021]图6为Western blot检测EGFR通路抑制情况下，AHNAK蛋白表达和IGF
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1R及EGFR通路蛋白磷酸化。
具体实施方式
[0022]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0023]实施例1AHNAK蛋白在肝病到肝癌进展和肝癌组织中的表达分析
[0024]健康人、慢性肝炎、肝癌早期的肝组织、癌旁组织和癌组织取自保存于本实验室的样品。
[0025]Western blot(WB)：细胞或组织经裂解液(RIPA)处理后提取总蛋白，然后经10％SDS
‑
PAGE电泳后电转至PVDF膜(Amersham Biosciences)，经5％(w/v)BSA室温封闭1小时，然后将膜与各种蛋白的一抗抗体4℃孵育过夜，PBST洗涤后，用HRP偶联的二抗37℃孵育1h。应用化学发光试剂ECL(GE)进行检测。
[0026]免疫组化检测：将肝癌患者的组织标本行4um厚切片，蜡块包埋，采用常规免疫组化技术检测AHNAK和IGF
‑
1R等分子的表达水平。
[0027]结果显示，AHNAK蛋白在健康样本中不表达，慢乙肝患者中少量表达，在HCC早期患者的肝脏组中大量表达。同时其在癌旁组织的表达量高于其在癌组织的表达量。这些结果提示AHNAK在HCC早期阶段高表达，为进一步进行干预研究奠定基础。
[0028]实施例2特异性的敲除AHNAK蛋白能够抑制HepG2细胞增殖
[0029]利用慢病毒载体特异性敲除AHNAK基因，并且筛选出稳定复制HepG2细胞系(HepG2
AHNAK
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KO
细胞)，检测5天CCK8细胞活性绘制生长曲线图(图2)，从结果发现敲除AHNKA蛋白的HepG2细胞增殖能力减低，这个结果直接证明AHNAK蛋白具有促进HCC发生发展的功能，为进一步研究其在HCC进展的作用及机制奠定基础。
[0030]实施例3发现AHNAK相关信号通路
[0031]免疫共沉淀联合蛋白质谱(coIP
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MS)：收集3位患者的癌旁组织和肝癌组织(n＝6)，依据质量加入适量还原性Co
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IP RIPA裂解液，研磨样本，提取组织总蛋白。以AHNAK抗体及protienA/G beats特异性结合AHNAK蛋白复合体，煮沸变性后进行于10％SDS
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抑制EGFR
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TKI药物在HCC中耐药性的靶标，其特征在于，所述靶标为AHNAK。2.根据权利要求1所述抑制EGFR
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TKI药物在HCC中耐药性的靶标，其特征在于，所述EGFR
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TKI药物为阿法替尼、达克替尼、艾维替尼、奥...

【专利技术属性】
技术研发人员：李康，张永宏，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京佑安医院，
类型：发明
国别省市：