一种校正测序错误的UMI序列设计方法及其应用技术

本申请公开了一种校正测序错误的UMI序列设计方法及其应用。本申请的UMI序列设计方法，包括将UMI序列设计为由X个碱基序列为单元进行Y次串联重复的序列，UMI序列如公式一：(N1…

A method of UMI sequence design for correcting sequencing errors and its application

【技术实现步骤摘要】
一种校正测序错误的UMI序列设计方法及其应用


[0001]本申请涉及测序错误校正
，特别是涉及一种校正测序错误的UMI序列设计方法及其应用。

技术介绍

[0002]高通量测序技术(High
‑
throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(“Next
‑
generation”sequencing technology)，简称“NGS”，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前所有二代测序的平台在对DNA序列进行测序前都需要构建一个基因文库，这个基因文库则需要包含通过引伸或者连接自定义的接头序列。接头一般分为几部分序列构成：文库扩增序列，index序列，测序引物结合序列，分子标签序列。
[0003]唯一分子标识符(UMI)是一种分子条形码，可在测序过程中提供纠错和提高准确性。这些分子条形码是用于唯一标记样本库中的每个短序列分子。UMI在给定样本库中的每个分子上都包含一个唯一的条形码。通过在每个原始DNA片段上加入单独的条形码，原始样本中存在的变异等位基因(真正的变异)可以与文库制备、目标富集或测序过程中引入的错误区分开来。使用UMI进行测序可以降低假阳性变异检出率并提高变异检测的灵敏度。由于起始材料中的每个核酸都标有唯一的分子条形码，因此生物信息学软件可以高度准确地过滤掉重复读数和PCR错误并报告独特的读数，从而在最终数据分析之前消除已识别的错误。目前在NGS测序行业中UMI已广泛用于各种测序应用。
[0004]由于现有UMI序列设计都是放在插入片段和测序接头之间，所以通常UMI序列都是位于测序读长的前几bp，而读长前几bp往往是测序质量比较差的位置，因此UMI序列在测序中会有较大的测序错误率。目前，对UMI序列的测序错误校正主要包括生物信息学校正技术和湿实验UMI校正技术；但是，现有的两种校正技术都存在不同的缺陷和不足。
[0005]生物信息学校正技术，主要是从生物信息角度出发开发相应的软件，通过复杂的数理建模方法来提高UMI序列的准确度。然而，现有的从生信算法解决UMI测序错误的问题在于失真，通过已经发生测序错误的结果回归校正无法完全还原原本的UMI序列，并且校正一是会浪费一部分数据，二是可能会带来新的错误。
[0006]UMI
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tools总结了2014
‑
2015年一些文章中对于UMI错误的解决方案，设置了一套基于邻接和定向方法来校正UMI错误，例如，从UMI序列和单个位点计数估计UMI的方法。在该方法使用UMI计数的情况下，将显示这些计数，利用不同颜色的碱基标注测序错误、PCR错误。Gencole也参考了UMI
‑
tools中对于UMI错误的校正逻辑。
[0007]但是，在实际使用中发现基于生物信息的校正方案在Raw Data深度低于100000
×
的测序中是有效的，可以解决一些由于UMI序列测序错误导致的数据丢失，对于最终UMI合并后的有效测序深度能有效提高。
[0008]然而，随着对低频突变检出的要求越来越高，测序深度越来越高，以上方案显示出潜在的缺陷：1.难以实现对于频率0.1％以下的突变准确检出；2.在ctDNA样本中，即便不断
加测数据的情况下，最终有效测序深度也很难实现>10000
×
；其原因在于，在测序饱和度越来越高的情况下，基于UMI
‑
tools的容错合并逻辑，会导致一些来自不同原始模板的reads错误合并越来越多。错误的合并会造成突变reads被UMI合并流程消除掉的概率越来越大，同时有效测序深度也会由于错误合并而降低。
[0009]湿实验UMI校正技术，例如专利CN110853709A是通过对UMI序列进行筛选，采用7个核苷酸为一组UMI，双端UMI的组合为268435456种；根据筛选原则，并为了增加UMI复杂度，排除2个以上相同碱基连续出现的序列，从单端16384组UMI中挑选出132组UMI。这样如果测出132种组合以外的序列即可认定为测序错误。分析中会进行回复校正，通过对单个碱基发生错误的UMI分子信息进行生物信息比对，对UMI分子进行回复校正，并在分析前剔除无法校正的错误UMI分子。
[0010]该专利的技术方案可以解决一定的问题，但仍然存在一些短板：
[0011]1.无法校正所有的1
‑
2bp错误，虽然筛选序列规避了所有2bp差异的UMI序列，但如果实际测序得到的错误UMI介于两个UMI之间，则无法校正或导致错误校正；例如：列表中umi_1序列为ACACACA，umi_2序列为ACACGAC,如果测序结果为ACACGCC则无法判断是由于umi_1测错2bp还是umi_2测错1bp，只能基于概率推测为umi_2测错1bp，但实际运用中是可能导致一些错误的，特别是对于测序饱和度越来越高的情况下，这些错误出现概率会越来越大。
[0012]2.同样的逻辑，对于2bp或2bp以上测序错误会更加难以校正，并且>＝2bp的错误有更大可能导致被识别为正确的UMI。
[0013]3.测序错误比例会随UMI序列长度而累积，7bp的UMI长度会将总体UMI区域测序错误率放大。
[0014]专利CN112466405A设计了另一种UMI序列进行校正，即分子标签由7个碱基的序列单元(B7序列)按照一定的方式串联制备而成，通过编码数学公式的计算，B7序列的最右边3个碱基是最左边4个碱基的校正码，B7序列中任意一个碱基出现错误，都能够通过解码校正数学公式校正回正确的编码序列。
[0015]该专利采用串联重复的设计：所述分子标签序列由n个(E2+B7+F2)单元组成，其中，E2为0～5个碱基；F2为0～5个碱基；B7是7个碱基的序列，n为1～20中任一整数。
[0016]从实际应用角度来说该专利的技术方案存在如下问题：
[0017]1)UMI的长度，按最短的可能来说，E2＝0，F2＝0，B7＝7，n＝1，那么整个UMI长度最短为7bp，但n＝1无法依赖串联重复设计进行校正。如果要实现串联重复校正，至少要n＝3，那么整个UMI序列长度则至少等于21bp，这个长度在实际应用中会导致大量测序读长浪费，对数据利用率和比对都会有影响。
[0018]2)B7的设计，最左边4个碱基需要最右边3个碱基来校正，但其实最右边3个碱基也是会出现测序错误的。这样校正逻辑就存在问题：如果最右边3个碱基无法校正，那么无法校正最左边4个碱基；如果最右边3个碱基可以校正，那么就不需要最左边4个碱基即可确定UMI序列。
[0019]3)该技术方案设计的UMI序列采用PCR扩增制备，在制备过程中会带来累积的PCR扩增错误，导致更多的不可控因素。
[0020]综上所述，现有技术中没有可以适用于100000
×
以上Rawbase深度测序、且不引入
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种校正测序错误的UMI序列设计方法，其特征在于：包括将UMI序列设计为由X个碱基序列为单元进行Y次串联重复的序列，UMI序列如公式一所示；公式一(N1...N
X
)
Y
公式一中，N表示A、T、C、G碱基中的任意一种，(N1...N
X
)表示X个碱基序列组成的单元，Y表示单元序列重复的次数；2≤X≤6，Y≥3。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：X为2或3，Y为3。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在公式一所示的UMI序列基础上还在5
’
端和/或3
’
端设计有1
‑
3bp的平衡碱基。4.一种校正测序错误的UMI序列，其特征在于：所述UMI序列为X个碱基序列为单元进行Y次串联重复的序列，UMI序列如公式一所示；公式一(N1...N
X
)
Y
公式一中，N表示A、T、C、G碱基中的任意一种，(N1...N
X
)表示X个碱基序列组成的单元，Y表示单元序列重复的次数；2≤X≤6，Y≥3。5.根据权利要求4所述的UMI序列，其特征在于：X为2或3，Y为3。6.根据权利要求4或5所述的UMI序列，其特征在于：在公式一所示的UMI序列基础上还在5
’
端和/或3
’
端具有1
‑
3bp的平衡碱基。7.一种含有权利要求4
‑
6任一项所述的UMI序列的接头序列。8.一种含有权利要求4
‑
6任一项所述的UMI序列或权利要求7所述的接头序列的核酸文库。9.一种校正UMI序列测序错误的方法，其特征在于：包括采用权利要求4
‑
6任一项所述的UMI序列，在进行测序时，X个碱基序列组成的单元中，每一位碱基都进行Y次测序和读取，统计每一位碱基Y次测序和读取的碱基类型，以及各碱基类型在Y次测序和读取中出现的次数；如果某一碱基类型出现的次数最多，且大于或等于(Y+1)
÷
2次，则将其确定为该位置的碱基类型；如果所有碱基类型都无法满足次数大于或等于(Y+1)
÷
2次，则不能确定该位置的碱基类型，无法校正，标记为N；所述碱基类型为A、T、C或...

【专利技术属性】
技术研发人员：于源，叶睿，黎美燕，李暾，廖信辉，李艳，李淼，王光杓，吴东方，高志博，
申请(专利权)人：深圳裕康医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：