一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中5-羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法技术

本发明专利技术公开了人工改造脱氨酶辅助的DNA中5

A modified deaminase assisted 5-hydroxymethylcytosine modified single base resolution localization method in DNA

【技术实现步骤摘要】
一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中5
‑
羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体是指一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中5
‑
羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法。

技术介绍

[0002]在哺乳动物的DNA中，胞嘧啶5位会在DNA甲基转移酶的作用下发生甲基化修饰，形成5
‑
甲基胞嘧啶(5mC)。5mC参与许多重要生物学过程，如基因组印迹、基因表达调控等，是一种重要的表观遗传学修饰。5
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甲基胞嘧啶可以被TET蛋白进一步地连续氧化为5
‑
羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5
‑
醛基胞嘧啶(5fC)和5
‑
羧基胞嘧啶(5caC)，形成新的修饰。这些新发现的修饰成分与多种重要生理功能密切相关，例如细胞分化、细胞重编程、神经系统发育、疾病的发生与发展等等。正常人的DNA修饰水平是稳定的，而异常的DNA修饰水平会导致一系列疾病的发生，比如癌症、老年痴呆症、糖尿病等需要。
[0003]研究这些DNA修饰的生物学功能需要对其进行准确的定位分析，然而这些DNA修饰的丰度较低，并且DNA中其它大量的未修饰成分(胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤)化学结构与修饰成分类似，在检测这些修饰成分时会对其造成严重干扰。所以上述两点是导致单碱基分辨定位分析需要高灵敏度、高选择性且准确检测的原因。
[0004]传统的亚硫酸氢盐测序方法是通过利用亚硫酸氢盐对未修饰的胞嘧啶(C)进行脱氨基而5mC及5hmC不能脱氨基的原理对DNA进行处理；同样的，在处理过程中，5fC和5caC也会被亚硫酸氢盐脱氨基。在后续的测序过程中C被读作胸腺嘧啶(T)，这种由C到T的转化可以直接获得5mC和5hmC的定位信息总和。
[0005]目前可以对全基因组5
‑
羟甲基胞嘧啶的直接进行单碱基分辨率测序的方法主要有两种，一种是衍生的亚硫酸氢盐测序方法，另一种为脱氨酶介导的测序方法。衍生的亚硫酸氢盐测序方法主要依靠β
‑
糖基转移酶将5hmC转化成糖基化的5hmC(β
‑
glucosyl
‑5‑
hydroxymethyl
‑2′‑
deoxycytidine，5gmC)，再利用TET蛋白将5mC转化成5caC，经亚硫酸氢盐处理，C、5fC及5caC被脱氨基形成尿嘧啶，而糖基化的5hmC不会脱氨基，在测序中读作C的位点就是测得的5hmC位点。而脱氨酶介导的测序方法亦需要β
‑
糖基转移酶将5hmC转化成5gmC，经脱氨酶APOBEC3A(人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A，A3A)处理后，C及5mC可以转变成尿嘧啶或胸腺嘧啶，在测序过程中读作C的位点就是测得的5hmC位点。目前的方法基本都需要对5hmC进行糖基化保护，使得操作比较繁琐。
[0006]A3A蛋白是一种胞嘧啶脱氨酶，可使单链DNA的序列中的C、5mC及5hmC有效地脱氨基成为尿嘧啶或者胸腺嘧啶，但相对于其对C和5mC的脱氨基能力而言，A3A蛋白对5hmC的脱氨基能力要小得多。如果对A3A蛋白进行改造使其保留对C及5mC的良好脱氨基能力但不能对5hmC脱氨基，则可以对所有位点的5hmC进行定位分析且不需要将5hmC转化成5gmC。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种人工改造的脱氨酶辅助的DNA中5
‑
羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，即一种能应用于DNA修饰测序领域中，无需亚硫酸氢盐处理的、具有高灵敏度、高选择性且操作简便的单碱基分辨率的5hmC定位测序方法。本专利技术的目的还在于提供所述人工改造的脱氨酶。
[0008]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0009]一种人工改造的胞嘧啶脱氨酶，其为氨基酸序列如SEQ ID NO.2、3所示的eA3A
‑
1、eA3A
‑
2。将DNA中的所有胞嘧啶位点分为GC、AC、TC及CC四种类型，可利用eA3A
‑
1对GC和AC位点的5hmC进行检测，利用eA3A
‑
2对TC和CC位点的5hmC进行检测。
[0010]一种人工改造脱氨酶辅助的DNA中5
‑
羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，包含如下步骤：
[0011](1)对待检DNA进行变性处理使其形成单链DNA。
[0012](2)分别用人工改造的脱氨酶eA3A
‑
1、eA3A
‑
2对单链DNA进行脱氨基处理，以检测待检DNA中处于不同序列特征中的5hmC(eA3A
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1对GC和AC位点的5hmC进行检测，eA3A
‑
2对TC和CC位点的5hmC进行检测)。
[0013](3)脱氨后的样品进行PCR扩增。
[0014](4)将PCR产物进行测序，经eA3A
‑
1处理的待检DNA中的GC和AC位点、G5mC和A5mC位点在测序中被读为GT和AT，而G5hmC和A5hmC位点在测序中被读为GC和AC；经eA3A
‑
2处理的待检DNA中的TC和CC位点、T5mC和C5mC位点在测序中被读为TT和TT，而T5hmC和C5hmC位点在测序中被读为TC和TC。
[0015]上述脱氨基处理是指具有脱氨基作用的eA3A
‑
1或eA3A
‑
2与含胞嘧啶的化合物之间的脱氨基反应。
[0016]步骤(1)中，DNA变性处理的方法优选为：将DNA在90℃
‑
95℃高温下孵育10
‑
20分钟后立即转入冰浴2
‑
5分钟使双链DNA变性成单链DNA。
[0017]步骤(2)中，单链DNA进行脱氨基处理所使用的脱氨基反应缓冲液为20
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30mM的4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸，pH为5.5
‑
6.5；脱氨基反应的温度为35℃
‑
37℃、反应时间为2
‑
4小时。
[0018]本专利技术原理见图1，改造的eA3A
‑
1对GC和AC、G5mC和A5mC进行脱氨基成为GU和AU、GT和AT，随后通过PCR扩增和测序读为GT和AT、GT和AT，而G5hmC和A5hmC中的5hmC能够抵抗eA3A
‑
1的脱氨基作用，因此通过PCR扩增和测序仍读为GC和AC。改造的eA3A
‑
2对TC和CC、T5mC和C5mC进行脱氨基成为TU和UU、TT和UT，随后通过PCR扩增和测序读为TT和TT、TT和TT，而T5hmC和C5hmC中的5hmC能够抵抗eA3A
‑
2的脱氨基作用，因此通过PCR扩增和测序读为TC和TC。将两者结合，进而实现对所有位点的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工改造的胞嘧啶脱氨酶，其特征在于：所述的胞嘧啶脱氨酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.2、3所示的eA3A
‑
1、eA3A
‑
2。2.一种脱氨酶辅助的DNA中5
‑
羟甲基胞嘧啶修饰单碱基分辨率定位分析方法，其特征在于：包含如下步骤：(1)对待检DNA进行变性处理使其形成单链DNA；(2)分别用权利要求1中所述的胞嘧啶脱氨酶eA3A
‑
1、eA3A
‑
2对单链DNA进行脱氨基处理；(3)脱氨后的样品进行PCR扩增；(4)将PCR产物进行测序。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁必锋，谢能彬，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：