一种高温普鲁兰酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种高温普鲁兰酶及其制备方法与应用。所述的酶序列见SEQ ID NO：2。本发明专利技术基于热球菌(Thermococcus sp.MCCC 1A01790)基因组测序数据分析获得普鲁兰酶PulTE基因序列，并对PulTE基因序列进行优化，通过人工合成的方法获得优化后的普鲁兰酶基因序列，并添加酶切位点BamHI和XhoI，将该优化后的基因克隆入pET

A high temperature pullulanase and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种高温普鲁兰酶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及采用基因工程手段获得一种高温普鲁兰酶及其制备方法与应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]淀粉是自然界最丰富的多糖聚合物之一，目前被广泛应用于化工、食品、环保等领域。淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉是α
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1,4糖苷键连接葡萄糖残基形成的线性聚合物，而支链淀粉不仅含有α
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1，4糖苷键，还含有α
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1,6糖苷键，因而会形成分支结构，这两种淀粉的聚合度都在几千个残基以上。目前工业上用于生产葡萄糖浆的淀粉大多数都含有75～85％的支链淀粉。大多数植物含有60％～90％的支链淀粉，如水稻、玉米、高梁、大麦、豌豆和马铃薯等，在糯米品种中支链淀粉含量高达90％以上。
[0003]与传统物理化学方法相比，酶解法降解淀粉多糖更加经济和高效。但是，目前大多数淀粉酶只能单一水解α
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1，4糖苷键，因此，在工业生产过程中，由于α
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1，6糖苷键的存在，导致淀粉糖化效率极低。
[0004]普鲁兰酶是一种淀粉脱支酶，可特异性水解淀粉、普鲁兰糖及相关分支多糖中的α
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1，6糖苷键。普鲁兰酶根据底物特异性的不同可分为2大类：Ⅰ型普鲁兰酶和Ⅱ型普鲁兰酶。Ⅰ型普鲁兰酶仅能水解α
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(1，6)糖苷键，而Ⅱ型普鲁兰酶能够水解α
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(1，4)和α
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(1，6)两种糖苷键。Ⅱ型普鲁兰酶是一种双功能酶，这种特性对于提高淀粉糖化效率和产量、降低工业成本具有重要意义。目前在许多微生物中已经发现了各种不同性质的普鲁兰酶。I型普鲁兰酶主要分布在中温微生物中，II型普鲁兰酶主要来源于嗜热微生物，如Geobacillus、Pyrococcus等。目前用于工业生产的II型普鲁兰酶极少，具有高活力和热稳定性好以及耐苛刻工业生产条件的双功能高温普鲁兰酶具有良好的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的是针对现有技术的不足，提供一种高温普鲁兰酶(命名为PulTE)及其应用。
[0006]所述的酶，蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]所述的酶，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本专利技术的另一目的，在于提供一种高温普鲁兰酶的制备方法，它包括如下步骤：
[0009](1)普鲁兰酶基因的设计及获得
[0010]基于热球菌(Thermococcus sp.MCCC 1A01790)基因组测序数据分析获得普鲁兰酶PulTE基因序列，并对所述基因序列进行优化，使其适合在大肠杆菌中进行表达，通过人工合成的方法获得优化后的普鲁兰酶PulTE基因序列，并添加酶切位点BamHI和XhoI。
[0011](2)重组质粒的构建
[0012]人工合成的带有BamHI和XhoI酶切位点的普鲁兰酶基因的DNA片段经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切后，被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET
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28a(+)上，将连
接产物转化大肠杆菌Escherichia coli TOP10受体菌株，筛选含有普鲁兰酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。
[0013](3)普鲁兰酶的表达与纯化
[0014]将含有普鲁兰酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli Rosetta受体菌株，用IPTG诱导普鲁兰酶蛋白表达，采用Ni
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Sepharose亲和层析(Ni Sepharose
TM 6Fast Flow试剂盒)纯化重组蛋白。纯化后的重组普鲁兰酶(rPulTE)的SDS
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PAGE电泳检测结果如图1所示。
[0015]本专利技术提供的酶的最适温度为80℃，在65～80℃条件下比较稳定，保温8h其酶活力保持80％以上，保温20h其酶活力保持50％以上；该酶在85℃稳定性也较好，保温4h其酶活力保持60％以上；该酶在90℃也具有一定的稳定性，保温2h其酶活力保持60％以上；该酶具有较宽的pH作用范围，最适pH为6.5，在pH5.5～8.0范围内其酶活力保持50％以上；该酶对普鲁兰糖和γ
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环糊精有很强的水解作用，可以水解α
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(1,4)糖苷键和α
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(1,6)糖苷键，是一种双功能酶，属于II型普鲁兰酶，在淀粉资源和普鲁兰糖的加工利用方面具有良好的应用前景；该酶对γ
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环糊精水解能力优于麦芽八糖，在麦芽八糖制备方面具有优势。
附图说明
[0016]图1为纯化后的酶蛋白的SDS
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PAGE电泳；
[0017]图2为酶对不同底物水解作用的效果；
[0018]图3为不同温度对酶活力的影响；
[0019]图4为酶在不同温度条件下的稳定性检测；
[0020]图5为不同pH对酶活力的影响；
[0021]图6为酶的完全水解产物分析；
[0022]图7为酶的开环反应水解产物分析。
具体实施方式
[0023]实施例1普鲁兰酶的制备
[0024]步骤如下：
[0025]实验材料
[0026]热球菌(Thermococcus sp.MCCC 1A01790)(中国海洋微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为1A01790，可通过购买方式得到)，大肠杆菌E.coil TOP10和E.coli Rosetta(购自ThermoFisher公司)；表达载体pET
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28a(+)(购自Novagen公司)；限制性内切酶BamHI和XhoI(购自全式金公司)；T4连接酶(购自Takara公司)；LB培养基(每升含1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl)；结合缓冲液(磷酸盐缓冲液：20mM磷酸盐，pH7.4)；漂洗缓冲液(500mM NaCl,10～50mM咪唑，20mM磷酸盐，pH7.4)；洗脱缓冲液(500mM NaCl，500mM咪唑，20mM磷酸盐，pH7.4)；3，5－二硝基水杨酸(DNS)(购自上海生工)；卡那霉素和氯霉素(购自上海生工)；Ni Sepharose
TM 6Fast Flow试剂盒(购自泰京公司)；30kDa超滤管(购自泰京公司)；普鲁兰糖(Pullulan)(购自Sigma公司)；α
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环糊精、β
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环糊精、γ
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环糊精、可溶性淀粉和糊精(购自上海生工)；直链淀粉和支链淀粉(购自阿拉丁公司)；糯米淀粉(购自天猫超市)；葡萄糖和麦芽糖(购自上海生工)；麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七
糖标准品(购自阿拉丁公司)。本专利技术中使用的含卡那霉素和氯霉素的LB培养基，其卡那霉素和氯霉素的浓度分别为30μg/mL和34μg/mL。
[0027]实验步骤(1)普鲁兰酶基因的设计及获得
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达高温普鲁兰酶的基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种重组载体，其含有权利要求1所述的一种表达高温普鲁兰酶的基因序列。3.一种重组菌，其含有权利要求2所述的重组载体。4.一种高温普鲁兰酶，其特征在于：其蛋白序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：周梅先，邵宗泽，闫康路，董彬彬，
申请(专利权)人：自然资源部第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：