一种线粒体靶向钙离子探针及其制备方法和采用其构建的工具细胞系技术

本发明专利技术提供一种线粒体靶向钙离子探针及其制备方法和采用其构建的工具细胞系，所述线粒体靶向钙离子探针为在原始载体的BglII和SalI位点间插入mt

A mitochondrial targeted calcium ion probe, its preparation method and tool cell line constructed by it

【技术实现步骤摘要】
一种线粒体靶向钙离子探针及其制备方法和采用其构建的工具细胞系


[0001]本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种线粒体靶向钙离子探针及其制备方法和采用其构建的工具细胞系及制备方法。

技术介绍

[0002]GCaMPs是一类基于GFP的Ca
2+
荧光探针，GCaMPs经历了多次改进，产生了一系列具有不同光谱、亲和力、高亮度、宽动态范围和快速动力学的探针，被广泛应用于钙成像研究。目前活体细胞的Ca
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动态检测工具有限，GCaMPs广泛应用于心血管系统和神经系统，包括GCaMP在内的遗传编码Ca
2+
指示剂(gene coded calcium indicator,GECIs)，以检测细胞质和线粒体Ca
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的改变。最广泛使用的GECIs之一是GCaMP6，可用于检测细胞内Ca
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对单个动作电位的反应，GCaMP6分为GCaMP6s、6m、6f三种类型，可根据实验需求分别用于慢、中、快动力学变化的钙信号检测。近年来，有多个GCaMPs经融合线粒体靶向序列后被用于线粒体钙稳态机制研究。王显花等(M.Chen et al.,Differential mitochondrial calcium responses in different cell types detected with a mitochondrial calcium fluorescent indicator,mito
‑
GCaMP2.Acta Bioch Bioph Sin 43,822
‑
830(2011).)合成mt
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GCaMP2探针，并将其应用于心肌细胞线粒体钙稳态机制研究(1)；线粒体靶向探针mt
‑
GCaMP5G/6s被用于研究星形胶质细胞和神经元培养过程中的线粒体Ca
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动力学机制变化；线粒体靶向探针mt
‑
GCaMP5被用于检测心肌细胞线粒体钙稳态变化。Jos
é‑
Carlos等(J.C.Fernandez
‑
Morales,M.Morad,Regulation of Ca(
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)signaling by acute hypoxia and acidosis in rat neonatal cardiomyocytes.J Mol Cell Cardiol 114,58
‑
71(2018).)将mt
‑
GCaMP6用于研究乳鼠心肌细胞在急性缺氧和酸中毒情况下线粒体钙摄取受抑制情况(2)；Mattia等运用4mtGCaMP6f研究MICU1对线粒体摄取的影响。
[0003]研究表明GCaMP具有各种副作用，主要与CaM有关，GCaMP可异常积聚在神经元的细胞核内，引起严重副作用如细胞损伤或死亡，在质粒转染或病毒感染的情况下，GCaMP中CaM高水平或长时间表达更为常见。GCaMP中的CaM过表达可能会损害细胞和组织的整体健康，如GCaMP2转基因小鼠的心脏肥大(类似外源性CaM过表达)，导致其下游CaMKII磷酸化(和活性)的增加以及心钠素的表达。
[0004]CaM已被证实位于线粒体和细胞浆以及细胞核中，是钙离子感应蛋白E
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F
‑
hand家族的典型传感器，通过铰链连接在一起折叠成两个区域，配体结合位点位于两个区域的界面，产生两种构象：与配体结合时的“开放”构象和离开配体时的“封闭”构象，当Ca
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与CaM结合时，GCaMP通过Ca
2+
‑
CaM
‑
M13相互作用诱导的cpEGFP构象变化，根据构象变化产生定量的光信号，从而起到钙的定量分析作用。细胞内Ca
2+
浓度的变化通过CaM的亚细胞分布、促进与许多靶蛋白的不同结合模式，引起下游特异性激活的CaM的各种构象状态。在心肌细胞中，Ca
2+
和CaM在细胞功能的调节中起着重要作用。CaM结合钙离子后，激活钙调素依赖性蛋白激酶(CaMK)，该激酶具有多种亚型，其中Ⅱ型(CaMKII)在心脏中最为丰富。CaM和CaMKII都激
活了许多细胞靶点，不仅参与Ca
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的调节，还参与蛋白激酶、基因表达和细胞凋亡。最近的研究还表明CaM/CaMKII与心脏病的发生和发展密切相关。
[0005]2018年新开发的GCaMPX探针通过在钙调素(CaM)末端加入额外的apoCaM结合基序，有效地保护CaV1依赖的激发
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转录耦合免受干扰。GCaMPX解决了有害的核积累、急性和慢性钙离子失调、异常的转录信号和细胞形态发生以及细胞凋亡等问题，同时仍显示出部分遗传自GCaMP的优秀钙离子感应特性，但目前尚未见GCaMP
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X探针应用于线粒体钙稳态研究。
[0006]线粒体靶向钙离子荧光探针是目前线粒体钙稳态机制研究的强大工具，但是化学指示剂由于存在染料泄漏、细胞毒性、易淬灭、无法在动物体内使用等问题，主要用于离体细胞短时程测量。GECIs是目前在体动物和细胞最广泛的钙离子检测方式，虽然GECI种类众多，但本文根据目前的研究情况，归结一些共同不足之处，主要包括以下4点：1、探针的性能(PH稳定性、动态范围、信噪比、灵敏度等)需要进一步改进，以更加适应线粒体等亚细胞器的钙稳态研究；2、改善探针的生物相容性，减少对内源性信号通路的影响，以适应探针在活细胞和体内的持续表达和动态监测；3、尚无探针指示线粒体内膜Ca
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稳态变化；4、在体器官水平的线粒体靶向定位，以及成像传感器的研究等。因此，建立一种高效、精准、操作简单的新探针，对于研究线粒体的功能具有重要意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对上述缺陷，提供一种新型线粒体靶向钙离子探针，mt
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GCaMPX在传统线粒体靶向钙离子探针mt
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GCaMP的基础上保留了原有探针的优良属性，同时拥有更高浓度的线粒体钙离子检测范围并能够显著降低氧化应激刺激下的细胞凋亡率以及线粒体损伤，具有良好的实际应用价值。
[0008]本专利技术提供如下技术方案：一种线粒体靶向钙离子探针，在原始载体的BglII和SalI位点间插入mt
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tag序列。
[0009]进一步地，所述原始载体为pN1
‑
GCaMPXC。
[0010]进一步地，用于插入mt
‑
tag序列的mt
‑
tag正向序列SEQ ID NO.1为：
[0011]5’‑
GGACTCAGATCTCGCCACATGTCCGTCCTGACGCC
‑3’
；
[0012]用于插入mt
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tag反向本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种线粒体靶向钙离子探针，其特征在于，在原始载体的BglII和SalI位点间插入mt
‑
tag序列。2.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向钙离子探针，其特征在于，所述原始载体为pN1
‑
GCaMPXC。3.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向钙离子探针，其特征在于，用于插入mt
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tag序列的mt
‑
tag正向序列SEQ ID NO.1为：5
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GGACTCAGATCTCGCCACATGTCCGTCCTGACGCC
‑3’
；用于插入mt
‑
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‑
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’‑
GATGAGTCGACGGTGGCGACCGGTGGATC
‑3’
。4.根据权利要求2所述的一种线粒体靶向钙离子探针，其特征在于，采用pN1
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GCaMPXC原始载体构建的探针为mt
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GCaMPX。5.根据权利要求1
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4任一所述的线粒体靶向钙离子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)使用限制性内切酶BglII及SalI对原始载体进行酶切PCR反应，37℃酶切过夜，酶切产物使用琼脂糖凝胶电泳进行目的片段分离；2)使用一步克隆试剂盒将目的片段连接到酶切后的载体上，利用感受态细胞DH5α转化连接产物，将摇好的菌液均匀涂在含有氨苄抗生素抗性的固体LB培养板上，37℃温箱中恒温放置16
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18h过夜，次日挑取单克隆菌落于氨苄抗生素抗性的L...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖东武，庄乐南，高云，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：