一种基因工程醋酸杆菌、其构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基因工程醋酸杆菌、其构建方法及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022536；其构建方法主要包括以下步骤：将醋酸杆菌组成型启动子、adhA基因和aldh基因依次连接到可以在醋酸杆菌中稳定复制的质粒中，得到重组质粒pBBR

A genetically engineered Acetobacter, its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种基因工程醋酸杆菌、其构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种基因工程醋酸杆菌、其构建方法及其应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]醋酸是常用的有机酸之一，是一类重要的发酵产品，在食品、农药、医药、纺织、化工等领域应用广泛。在食品行业中，醋酸是重要的调味品和辅料之一，还被用作酸化剂、防腐剂、增香剂等。生物合成法被认为是生产食醋的有效而必要的方法，醋酸菌是其中主要的微生物，醋酸菌是以氧气作为终端电子受体，氧化醇类、糖类、糖醇类生成相应有机酸、酮、糖酮的一类细菌的总称，其中醋酸杆菌属和葡萄糖杆菌属具有较高的乙醇氧化和醋酸耐受能力，常用于醋酸的发酵生产。目前大多数醋酸菌工业生产菌株是通过诱变获得的，包括紫外诱变、离子束注入、化学诱变选育等方法，以提高醋酸菌酒精转化率、耐酸等性状，但这些筛选方法工作量大且成功率低。
[0003]醋酸菌发酵能力主要与两种酶的活性有关，即位于细胞外侧的乙醇脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase,adh）和乙醛脱氢酶（Aldehyde Dehydrogenase aldh）。发酵主要包括两个阶段：底物乙醇在膜结合的乙醇脱氢酶的催化下氧化成乙醛，乙醛吸水形成乙醛水化物接着在乙醛脱氢酶的作用下生成醋酸，其酶活水平直接影响着产酸。周秉辰的研究表明醋酸菌的产酸速率与菌体adh和aldh的活力有着极明显的相关性，酶活力越高产酸速率越快（周秉辰 . 食醋生产中醋酸菌乙醇脱氢酶的活性与产酸速率关系的研究 [J]. 中国酿造， 2009 （ 11 ）： 58
‑
60）。因此，提高醋酸菌中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶活水平，对于促进醋酸工业的发展，提高我国醋酸在国际行业市场上的竞争力具有重要的现实意义。目前对醋酸杆菌的改造仅集中在通过一些单个的耐酸元件或应激蛋白过表达上来提高醋酸杆菌的耐酸和产酸，并没有结合醋酸杆菌发酵代谢途径特点，对醋酸产量的提高效果不显著。
[0004]启动子用于控制基因表达（转录）的起始时间和表达程度，在菌株代谢工程改造中具有重要作用，是基因工程中的重要工具，是基因表达（转录）调控的重要组成部分。利用基因工程重组表达蛋白时常用的启动子一般有组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子是指在该类启动子控制下，基因表达大体恒定在一定水平，不同条件下蛋白表达水平没有明显差异。目前对巴氏醋酸杆菌启动子的转录调控水平研究较少，使得基于启动子的关键代谢途径基因的精细调控研究受到限制。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术的上述问题，提供一种基因工程醋酸杆菌、其构建方法及其应用。本专利技术使用在醋酸菌中具有高效转录活性的组成型启动子，进一步提高目的基因adhA和aldh的表达量，进而提高醋酸杆菌产乙酸的能力。
[0006]本专利技术的目的之一在于提供一种基因工程醋酸杆菌（AS1.41/pBBR1MCS
‑2‑
adhA
‑
aldh）。
[0007]本专利技术中的菌株已提交菌种保藏。
[0008]【生物保藏说明】保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉；保藏日期：2022年5月3日；保藏编号：CCTCC NO：M2022536；分类命名：巴氏醋酸杆菌AS1.41/pBBR1MCS
‑2‑
adhA
‑
aldh Acetobacter pasteurianusAS1.41/pBBR1MCS
‑2‑
adhA
‑
aldh。
[0009]本专利技术的目的之二在于提供一种上述基因工程醋酸杆菌的构建方法，包括以下步骤：步骤A、将醋酸杆菌组成型启动子、adhA基因和aldh基因依次连接到可以在醋酸杆菌中稳定复制的质粒中，得到重组质粒pBBR
‑
pro
‑
adhA
‑
pro
‑
aldh；步骤B、将经过步骤A得到的重组质粒pBBR
‑
pro
‑
adhA
‑
pro
‑
aldh转入醋酸菌中，即得基因工程醋酸杆菌；其中，步骤A中，所述醋酸杆菌组成型启动子、adhA基因和aldh基因均来源于巴氏醋杆菌AS1.41；步骤A中，可以在醋酸菌中稳定复制的质粒为pBBR1MCS
‑
2质粒。
[0010]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以作出如下的改进：进一步，所述步骤A具体包括如下步骤：步骤A1、PCR扩增醋酸杆菌组成型启动子；步骤A2、构建重组质粒pBBR
‑
pro
‑
adhA；步骤A3、构建重组质粒pBBR
‑
pro
‑
aldh；步骤A4、以步骤A2的重组质粒pBBR
‑
pro
‑
adhA为模板，进行PCR反应，得到扩增目的基因pro
‑
adhA序列；步骤A5、将步骤A3的重组质粒pBBR
‑
pro
‑
aldh和步骤A4得到的pro
‑
adhA序列进行连接反应，构建重组质粒pBBR
‑
pro
‑
adhA
‑
pro
‑
aldh。
[0011]进一步，所述步骤A1的具体操作为：以巴氏醋杆菌AS1.41基因组为模板，设计引物对一和引物对二，分别进行PCR反应，采用引物对一得到醋酸杆菌adhA的组成型启动子序列；采用引物对二得到醋酸杆菌aldh的组成型启动子序列；所述引物对一为：其中，单下划线部分为酶切位点上游SacⅠ，下游SacⅠ，双下划线部分为保护碱基；所述引物对二为：
其中，单下划线部分为酶切位点上游SalⅠ，下游SalⅠ，双下划线部分为保护碱基。
[0012]进一步，所述步骤A2的具体操作为：步骤A21、以巴氏醋杆菌AS1.41基因组为模板，设计引物对三，进行PCR反应，得到adhA基因序列；其中，PCR反应条件为:94
‑
95℃预变性5分钟，94
‑
95℃变性30秒，50
‑
60℃退火30秒，72℃延伸3
‑
5分钟，30
‑
35个循环后72℃10分钟；所述引物对三为：其中，单下划线部分为酶切位点，上游SacⅠ，下游HindⅢ，双下划线部分为保护碱基；步骤A22、将质粒pBBR1MCS
‑
2用限制性内切酶SacⅠ和HindⅢ处理，步骤A21得到的adhA基因序列用限制性内切酶SacⅠ和HindⅢ处理，37℃条件下，处理0.5
‑
10h，纯化回收；将酶切纯化回收的质粒和adhA基因序列按摩尔比1：3
‑
10混合，利用T
4 DNA连接酶进行连接反应，16
‑
21℃，连接1
‑
12h；然后将连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞中，获得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程醋酸杆菌，其特征在于，于2022年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022536；分类命名为：巴氏醋酸杆菌AS1.41/pBBR1MCS
‑2‑
adhA
‑
aldh Acetobacter pasteurianusAS1.41/pBBR1MCS
‑2‑
adhA
‑
aldh。2.一种如权利要求1所述的基因工程醋酸杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A、将醋酸杆菌组成型启动子、adhA基因和aldh基因依次连接到可以在醋酸杆菌中稳定复制的质粒中，得到重组质粒pBBR
‑
pro
‑
adhA
‑
pro
‑
aldh；步骤B、将经过步骤A得到的重组质粒pBBR
‑
pro
‑
adhA
‑
pro
‑
aldh转入醋酸菌中，即得基因工程醋酸杆菌；其中，步骤A中，所述醋酸杆菌组成型启动子、adhA基因和aldh基因均来源于巴氏醋杆菌AS1.41；步骤A中，可以在醋酸菌中稳定复制的质粒为pBBR1MCS
‑
2质粒。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A具体包括如下步骤：步骤A1、PCR扩增醋酸杆菌组成型启动子；步骤A2、构建重组质粒pBBR
‑
pro
‑
adhA；步骤A3、构建重组质粒pBBR
‑
pro
‑
aldh；步骤A4、以步骤A2的重组质粒pBBR
‑
pro
‑
adhA为模板，进行PCR反应，得到扩增目的基因pro
‑
adhA序列；步骤A5、将步骤A3的重组质粒pBBR
‑
pro
‑
aldh和步骤A4得到的pro
‑
adhA序列进行连接反应，构建重组质粒pBBR
‑
pro
‑
adhA
‑
pro
‑
aldh。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A1的具体操作为：以巴氏醋杆菌AS1.41基因组为模板，设计引物对一和引物对二，分别进行PCR反应，采用引物对一得到醋酸杆菌adhA的组成型启动子序列；采用引物对二得到醋酸杆菌aldh的组成型启动子序列；所述引物对一为：其中，单下划线部分为酶切位点上游SacⅠ，下游SacⅠ，双下划线部分为保护碱基；所述引物对二为：其中，单下划线部分为酶切位点上游SalⅠ，下游SalⅠ，双下划线部分为保护碱基，其中，PCR反应条件为：94
‑
95℃预变性5分钟，94
‑
95℃变性30秒，50
‑
60℃退火30秒，72℃延伸 40
‑
60秒，30
‑
35个循环后72℃10分钟。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A2的具体操作为：步骤A21、以巴氏醋杆菌AS1.41基因组为模板，设计引物对三，进行PCR反应，得到adhA
基因序列；其中，PCR反应条件为:94
‑
95℃预变性5分钟，94
‑
95℃变性30秒，50
‑
60℃退火30秒，72℃延伸3
‑
5分钟，30
‑
35个循环后72℃10分钟；所述引物对三为：其中，单下划线部分为酶切位点，上游SacⅠ，下游HindⅢ，双下划线部分为保护碱基；步骤A22、将质粒pBBR1MCS
‑
2用内切酶SacⅠ和HindⅢ处理，步骤A21得到的adhA基因序列用内切酶SacⅠ和HindⅢ处理，37℃条件下，处理0.5
‑
10h，纯化回收；将酶切纯化回收的质粒和adhA基因序列按摩尔比1：3
‑
10混合，利用T
4 DNA连接酶进行连接反应，16
‑
21℃，连接1
‑
12h；然后将连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞中，获得重组质粒pBBR
‑
adhA；步骤A23、将步骤A22得到的重组质粒pBBR
‑
adhA用限制性内切酶SacⅠ处理，步骤A1得到的醋酸杆菌adhA的组成型启动子序列用内切酶SacⅠ处理，37℃条件下，处理0.5
‑
10h，纯化回收；将酶切纯化回收的质粒和启动子序列按摩尔比1：3
‑
10混合，利用T
4 DNA连接酶进行连接反应，反应温度16
‑
21℃，连接1
‑
12h；然后将连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞中，获得重组质粒pBBR
‑
pro
‑
adhA。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A3的具体操作为：步骤A31、将质粒pBBR1MCS
‑
2和步骤A1得到的醋酸杆菌aldh的组成型启动子序列用限制性内切酶SalⅠ处理，37...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海灵，林剑，石学梅，朱雅清，安志强，孙利芹，
申请(专利权)人：烟台大学，
类型：发明
国别省市：