磷酸化tau蛋白检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及诊断阿尔茨海默症标志物的试剂盒，尤其涉及检测磷酸化tau蛋白的试剂盒，另外还涉及荧光染料和特定的磁珠在制备检测磷酸化tau蛋白的试剂盒中的用途。所述试剂盒基于单分子检测技术及双抗夹心法来检测磷酸化tau蛋白，还涉及用于检测磷酸化tau蛋白的单分子检测系统，能够在快速检测的同时实现高的灵敏度，且CV值小，而且检测系统的成本低，能够准确测定磷酸化tau蛋白的浓度。确测定磷酸化tau蛋白的浓度。确测定磷酸化tau蛋白的浓度。

Phosphorylated tau protein detection kit

【技术实现步骤摘要】
磷酸化tau蛋白检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及免疫检测领域，尤其是涉及一种检测磷酸化tau蛋白的试剂盒、及荧光染料和磁珠在制备检测磷酸化tau蛋白的试剂盒中的用途以及用于检测磷酸化tau蛋白的单分子检测系统。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默症(Alzheimer
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s disease，AD)是老年痴呆症一种常见形式，目前尚无有效疗法。该病患不仅患者自身痛苦，而且对于其家庭乃至整个社会都会造成较消极的影响。迄今为止，AD发病的确切机理尚未完全清楚。tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要分布在神经元，其次是在神经胶质细胞。正常情况下，转录后的tau发生磷酸化修饰而有利于微管的稳定。但过磷酸化的tau蛋白(p
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htau)丧失了催化微管装配和稳定微管结构的正常生物活性，不仅与正常微管相关蛋白互相竞争，影响微管形成，且促使正常微管相关蛋白与微管分离，使微管崩解，轴突变性，影响神经递质的合成、运输、释放和摄取，造成神经细胞间的物质运输障碍，从而导致神经退行性变。
[0003]有研究表明，tau蛋白过度磷酸化是AD脑神经元降解的重要初始步骤，tau蛋白过度磷酸化的产物磷酸化tau
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181蛋白的增加，可启动血脑屏障外的磷酸化tau
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181蛋白的生成，最终导致血液中磷酸化tau
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181含量的增加。因此，检测血清中磷酸化tau
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181蛋白的含量对诊断AD有着较高的临床价值。也有研究表明，血浆中磷酸化tau<br/>‑
181浓度可作为唐氏综合征患者中阿尔茨海默症的潜在生物标志物(参见非专利文献1)。另外，有研究表明，血浆磷酸化tau217作为AD早期诊断标记物，其灵敏性和特异性高，能够有效区分AD与非AD，或能提前20年诊断AD，与已知的血浆及MRI成像的生物标记物相比具有诸多优势，有望替代既往的指标成为更加精准便捷的早期诊断生物标志物，使AD早期诊断及干预成为可能(参见非专利文献2)。在中国阿尔兹海默病痴呆诊疗指南(2020年版)中也明确提到了血液中的磷酸化tau
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181和磷酸化tau
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217浓度可以作为AD检查的指标。
[0004]目前已知的P
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Tau蛋白检测方法主要有放射免疫测定法(RIA)、均相酶免疫检测法、酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱和质谱联用法(GC
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MS)、化学发光免疫双抗体夹心法等。其中，关于放射免疫测定法，试剂的半衰期短，污染大，费用高，有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果。关于酶联免疫法，目前有市售的检测试剂盒，但操作步骤烦琐，易出错，实验耗时4个小时以上，特异性较差，经常会出现假阳性、假阴性的结果判读。关于色谱法，目前商品化非常少，因需要专业的设备，且灵敏度低，只适合于实验室分析。关于化学发光免疫双抗体夹心法，有专利文献1记载，采用多臂聚乙二醇
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氨基对磁性微球本体进行化学修饰，再将含羧基的线性高分子聚合物共价偶联到前述经化学修饰的磁性微球表面，处理步骤复杂，并且灵敏度只达到ng/mL级别；专利文献2记载了一种磁微粒分离化学发光免疫测定法，采用竞争法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清或血浆样品中的Tau蛋白(TAU)含量，但其灵敏度同样只达到ng/mL级
别。
[0005]单分子检测技术因其原理上的突破，与现有的ELISA、化学发光方法相比，灵敏度极高，因而在研究应用单分子技术来检测生物标志物。本申请的专利技术人提出了一种单分子检测方法(参见专利文献3)，其中，使用了原位信号增强纳米粒子和磁珠，基于双抗夹心法，对cTnI抗原、IL
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6抗原、DNA等进行了单分子检测，但未提及如何检测磷酸化tau蛋白，也未关注磁珠的直径、浓度等对磷酸化tau蛋白检测的影响。
[0006]在体外诊断现有的主流免疫学平台中，电化学发光已经是灵敏度最高的检测平台，其已获FDA批准的用于脑脊液(Cerebrospinal Fluid,CSF)中P
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tau181检测的试剂盒最低检测限为8pg/mL(参见中国医疗网med.china.com.cn)。
[0007]现有技术文献
[0008]非专利文献
[0009]非专利文献1：“Phosphorylated tau181 in plasma as a potential biomarker for Alzheimer
’
s disease in adults with Down syndrome”,Alberto LIeo等人，nature communication，12,4304(2021)；
[0010]非专利文献2：“Discriminative Accuracy ofPlasma Phospho
‑
tau217for Alzheimer Diseasevs Other Neurodegenerative Disorders”，Oskar Hansson等人，《JAMA》，2020年7月；
[0011]专利文献
[0012]专利文献1：CN113533746A；
[0013]专利文献2：CN109580955A；
[0014]专利文献3：CN111771126A

技术实现思路

[0015]专利技术要解决的课题
[0016]专利文献1～2的检测灵敏度均较低，只有ng/ml级别。专利文献3未提及如何检测磷酸化tau蛋白，也未关注磁珠的直径、浓度等对磷酸化tau蛋白检测的影响。本申请的专利技术人尝试将专利文献3的单分子检测方法用于磷酸化tau蛋白试剂盒的开发，但由于磷酸化tau蛋白与该文献中记载的cTnI抗原、IL
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6抗原、DNA等完全不同，在将cTnI抗原、IL
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6抗原、DNA等的检测体系应用于磷酸化tau蛋白的检测时出现灵敏度低的状况，检测限只能达到约90pg/mL。另外，需要说明，缩短检测时间和提高检测灵敏度之间存在trade
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off关系，难以同时实现检测时间的缩短和灵敏度的提高。
[0017]为了解决上述课题，申请人针对捕获抗体的种类、检测抗体的种类、荧光染料的种类、体系的pH、磁珠的基团种类等均反复进行了优化，但灵敏度仍然较低，最低检测限只能达到75pg/mL。关于磁珠的工作浓度，在免疫检测领域中，为了提高捕获效率，通常选择的浓度在0.5mg/mL以上。故本申请的专利技术人在初始优化过程中同样使磁珠的工作浓度为0.5mg/mL以上(在专利文献3中也是采用该工作浓度)。然而，如前文所述的，本申请的专利技术人在使用以往的常见体系来构建试剂盒并测定磷酸化tau蛋白的浓度时，检测下限只能达到75pg/mL，无法满足对于阿尔本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测磷酸化tau蛋白的试剂盒，其特征在于，包含经捕获抗体包被的磁珠、和标记有荧光染料的检测抗体，其中，所述捕获抗体和检测抗体能够分别与磷酸化tau蛋白的不同位点结合，所述荧光染料含有荧光材料和载体，且粒径为180～450nm，所述磁珠的直径为0.3～5μm，工作浓度为0.01mg/mL以上且小于0.5mg/mL。2.如权利要求1所述的检测磷酸化tau蛋白的试剂盒，其中，所述磁珠的直径为0.5～2.2μm，优选为0.8～2μm，更优选为1～1.5μm。3.如权利要求1或2所述的检测磷酸化tau蛋白的试剂盒，其中，所述磁珠的工作浓度为0.05～0.25mg/mL，优选为0.08～0.22mg/mL，更优选为0.1～0.2mg/mL。4.如权利要求1～3中任一项所述的检测磷酸化tau蛋白的试剂盒，其中，所述磁珠的表面修饰有羧基、氨基或甲苯磺酰基中的一种或多种，优选修饰有羧基，其中，当磁珠表面修饰有羧基时，羧基浓度为15～30微当量/克(μeq/g)。5.如权利要求1～4中任一项所述的检测磷酸化tau蛋白的试剂盒，其中，所述荧光材料为荧光素、稀土元素、稀土螯合物、荧光蛋白、量子点以及上转换纳米粒子，所述载体为二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯。6.如权利要求1～4中任一项所述的检测磷酸化tau蛋白的试...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁爱梦，安源，官志超，
申请(专利权)人：苏州宇测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：