一种提高等位基因区分力的PCR方法及PCR试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种提高聚合酶链式反应(DNA polymerase chain reaction,PCR)特异性和敏感性的等位基因检测方法，其常用于检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)或体细胞突变(somatic mutation)等次要等位基因。更具体地，本发明专利技术涉及一种基于PCR的单核苷酸突变基因型分析(SNP genotyping)及/或体细胞突变检测(somatic mutation detection)技术，其在欲选择性扩增等位基因的PCR溶液中添加部分或全部形成双链的区分力增强的寡核苷酸，当引物3'末端碱基在与模板互补(3'

A PCR method and PCR kit for improving allelic discrimination

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种提高等位基因区分力的PCR方法及PCR试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种提高聚合酶链式反应(DNA polymerase chain reaction,PCR)特异性和敏感性的等位基因检测方法，其常用于检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)或体细胞突变(somatic mutation)等次要等位基因。更具体地，本专利技术涉及一种基于PCR的单核苷酸突变基因型分析(SNP genotyping)及/或体细胞突变检测(somatic mutation detection)技术，其在欲选择性扩增等位基因的PCR溶液中添加部分或全部形成双链的区分力增强的寡核苷酸(discrimination boosting oligonucleotide；与以下本专利技术的描述及附图中的“dbOligo”互用)，当引物3'末端碱基在与模板互补(3'
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matched)时，不会对PCR扩增造成太大影响或无任何影响，而非互补(3'
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mismatched)时，PCR扩增则会受到强烈抑制。

技术介绍

[0002]确认与遗传病、癌症等疾病相关的基因突变，即单核苷酸多态性、增添
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缺失等基因突变，对于预测治疗、确定治疗方法、治疗预后及复发观察等非常重要。此外，确认或识别这种遗传变异，对于农业、食品领域的物种选育和选择，及原产地和品种的辨别等非常有用。
[0003]遗传变异可能先天存在于生物体中，也可能因生长过程中的环境或内源性原因而发生。人体等中最常见的遗传变异形式为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。在本专利技术的以下描述中，将举例描述代表各种遗传变异的SNPs。
[0004]用于辨别包含人类在内的生物体所具有的SNPs的技术方法中，最常见且经济方便的方法是应用聚合酶的基因扩增技术，即聚合酶链式反应(PCR，polymerase chain reaction)技术，特别是，能够在PCR过程中实时测量突变量的技术为定量实时PCR(quantitative real time PCR；qPCR或实时PCR)。
[0005]核酸的定量定性和定量检测技法——实时PCR，被应用于保健、农业、食品、环境等多个领域。于1990年初开发的实时PCR不断改进技术局限性，现已发展成为一种更准确、更精密的技法。
[0006]特别是，在使用实时PCR的基因辨别试剂盒的开发中，非特异性信号的产生，突变及野生基因序列的低区分力，被视为实时PCR最具代表性的技术局限。
[0007]特别是，开发实时PCR技术作为检测癌症、引发感染的病原体等的诊断技术，控制非特异性信号是必需的。因非特异性信号而出现假阳性时，会降低检测的可靠性，特别是，在需要极少量检测的非侵入性液体活检(liquid biopsy)等诊断技术中，为确保准确诊断少量的靶突变，非常需要一种提高PCR效率和提高特异性(specificity)的技术。为提高PCR的效率和特异性，一直在开发一种添加到PCR溶液中的组合物；或是研究一种特殊探针(probes)或引物(primers)；或是寻求一种改进酶的方法。
[0008]提高PCR的效率和特异性的方法，可举例如下。
[0009]A.PCR溶液中添加组合物
[0010]有关添加到PCR溶液中的组合物，一直在研究的添加组合物，其主要用途在于，提高PCR的反应性或产生引物二聚体(primer dimers)；或产生由所用引物与非特异性靶结合后产生的非特异性PCR产物；解决因高GC比例和特异高阶结构形成而导致的PCR效率下降的问题。这种组合物包括二甲基亚砜(DMSO，dimethylsulfoxide)、甜菜碱(betaine)等。另外，还报道了为确保的所谓的“热启动PCR(HotStart PCR)”，阻断低温下进行的反应并使PCR在高温下进行，以防止非特异性扩增的许多方法。
[0011]其中，已知的“热启动PCR(HotStart PCR)”方法包括：添加DNA聚合酶(DNA polymerase，DNAP)特异性单克隆抗体的方法{Biotechniques(1994)16(6):1134
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1137}，添加抑制DNA聚合酶活性的单链寡核苷酸，即所谓的“适体(aptamer)”的方法{US/005693502A(1997)，J.Mol.Biol.271:100
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111(1997)；Nucleic Acids Research Supplement No.3:309
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310(2003)}，或使用在低温下与DNA聚合酶具有结合能力且抑制DNA聚合酶活性，而在高于特定温度的PCR条件下不形成双螺旋且不抑制DNA聚合酶活性的双链核苷酸，抑制非特异性DNA合成的方法{J.Mol Biol.264(2):268
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278(1996)；US 8,043,816 B2(2011)}。
[0012]B.酶的改进
[0013]现已开发许多方便用于PCR的DNA聚合酶，其可抑制非特异性信号或提高等位基因的区分力。PCR技术通常使用耐热性DNA聚合酶。DNA聚合酶可分为7种以上的族(Family)，但用于PCR技术的耐热性聚合酶，主要选自属于A族的包括Taq DNA聚合酶在内的耐热性细菌来源的酶族，及属于B族的包括Pfu DNA聚合酶在内的古细菌来源的酶族。
[0014]其中，在Taq DNA聚合酶所属的族中，普遍存在5'
→
3'核酸酶(同时具有核酸外切酶和核酸内切酶，也称为Flap核酸内切酶或FEN1)活性，该活性对于通过水解探针(TaqMan Probe)的降解来释放特定信号(specific signal)至关重要。由于Taq DNA聚合酶不具有3'
→
5'核酸酶活性，因此，非常适用于使用3'末端与模板DNA非互补的引物进行的PCR。对于3'末端非互补的等位基因特异性(AS，allele specific)引物或扩增阻碍突变系统(ARMS，amplification refractory mutation system)引物时，突变和野生型或两种等位基因的扩增效率根据3'碱基(base)的配对和错配来确定，可得出较好的临床效果。但是，在多数情况下，3'为非互补的引物时也会被部分扩增，因此，其在检测大量混入到野生型中的突变的高灵敏度诊断中，常常会导致辨别错误。
[0015]因此，区分酶的3'末端的配对和错配，对于提高SNP或突变辨别特异性尤为重要。因此，已报道一种聚合酶，其在识别等位基因特异性引物的3'末端序列的配对及错配方面的能力得到增强{PLos One.9(5):e96640(2014)；KR 10
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2017
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0088373(2017)；US 0034879A1(2013)；WO 082449A2(2015)；US 9267本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种靶DNA序列的突变检测用PCR试剂盒，其包括：(A)一种或多种模板的正向引物和反向引物，其具有潜在突变位点的靶DNA序列；(B)DNA聚合酶，其用于聚合来自与所述模板结合的正向引物和反向引物的DNA；及(C)一种或两种以上的区分力增强的寡核苷酸，其中，所述模板与正向引物、反向引物非互补，可与所述聚合酶可逆结合，部分或全部形成双链。2.如权利要求1所述的突变检测用PCR试剂盒，其还包括：(D)一种以上的模板，其包含具有潜在突变位点的靶DNA序列。3.一种突变检测用PCR试剂盒，其中，所述正向引物3'末端的第一个碱基对应于靶DNA序列的潜在突变位点。4.如权利要求1所述的突变检测用PCR试剂盒，其中，所述正向引物是等位基因特异性(AS，allele specific)引物或扩增阻碍突变系统(ARMS，amplification refractory mutation system)引物。5.如权利要求1所述的突变检测用PCR试剂盒，其中，所述区分力增强的寡核苷酸，选自DNA双链，RNA/DNA杂交双链，双链寡核苷酸，或可部分或全部形成DNA双链的部分或全部互补的寡核苷酸单链，可部分或全部形成DNA/RNA杂交双链的部分或全部互补的寡核苷酸单链，可部分或全部形成双链寡核苷酸的部分或全部互补的寡核苷酸单链，及可部分或全部形成发夹双链的寡核苷酸中的至少一种。6.如权利要求1所述的突变检测用PCR试剂盒，其中，所述区分力增强的寡核苷酸为任意序列。7.如权利要求1所述的突变检测用PCR试剂盒，其中，所述靶DNA序列的突变为单核苷酸多态性。8.如权利要求1所述的突变检测用PCR试剂盒，其中，所述DNA聚合酶为耐热性DNA聚合酶。9.如权利要求8所述的突变检测用PCR试剂盒，其中，所述DNA聚合酶为野生型或突变型DNA聚合酶。10.如权利要求1所述的突变检测用PCR试剂盒，其中，所述区分力增强的寡核苷酸为至少10个碱基且不超过100碱基。11.如权利要求1所述的突变检测用PCR试剂盒，其中，所述区分力增强的寡核苷酸为至少15个碱基且不超过50个碱基。12.如权利要求1所述的突变检测用PCR试剂盒，其中，所述区分力增强的寡核苷酸的Tm值等于或高于PCR反应的退火温度。13.如权利要求1所述的突变检测用PCR试剂盒，其中，所述区分力增强的寡核苷酸的Tm值为50～85℃。14.如权利要求1所述的突变检测用PCR试剂盒，其还包括：可转移荧光共振能量且用荧光基团和淬灭基团修饰的探针。15.一种基因突变检测方法，其包括：A)提供包含潜在突变位点...

【专利技术属性】
技术研发人员：金载钟，林時圭，朴仁敬，庆雅英，李甫媄，柳正铉，車善浩，白承祐，
申请(专利权)人：基诺泰科有限公司，
类型：发明
国别省市：