mRNA及其制造方法，蛋白质的制造装置和蛋白质的制造方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供一种用于蛋白质的合成的mRNA，包括：包含起始密码子和终止密码子的翻译区；以及位于起始密码子的5

MRNA and its manufacturing method, protein manufacturing device and protein manufacturing method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】mRNA及其制造方法，蛋白质的制造装置和蛋白质的制造方法


[0001]本专利技术涉及一种mRNA及其制造方法，以及蛋白质的制造装置和蛋白质的制造方法。

技术介绍

[0002]已知，通过将硫代磷酸基(phosphorothioate基：PS)引入核酸，能够带来生物学的稳定性。引入了PS的核酸，已经在反义核酸和siRNA的分子结构中使用，在已上市的寡核酸医药品中也有使用。用PS修饰(以下，有时称作“PS修饰”)的mRNA(以下，有时称作“PS－mRNA”)，能够使用T7 RNA聚合酶或大肠杆菌RNA聚合酶，并使用在三磷酸的α位引入PS的底物核苷酸三磷酸(NTPαS)，酶促地进行配制。
[0003]虽然NTPαS的合成方法已经得到开发，但是PS修饰几乎没有用于mRNA，近30年前的报告也只有几例(例如，参照非专利文献1～3)。这些报告，涉及使用大肠杆菌的无细胞翻译系统的蛋白质合成。
[0004]非专利文献1中公开了如下主旨：合成了由poly－U序列构成的PS－mRNA，并且以天然序列的45％的效率合成了聚丙氨酸(倒数第3段)。在本文献中，序列非常有限，并且生成物严格地不能说是蛋白质。
[0005]非专利文献2中，以T7噬菌体DNA为模板，使用T7 RNA聚合酶通过试管内转录法制作PS－mRNA。在本文献还报告了，通过嗜热/栖热菌以及大肠杆菌的无细胞翻译系统评价PS－mRNA的翻译活性，一种碱基用NTPαS进行取代的PS－mRNA在这些无细胞系统中示出了与无取代体相比较最大为2倍的蛋白质合成(Fig.3)。
[0006]非专利文献3中，通过体外转录法(In vitro transcription)制成大肠杆菌二氢叶酸还原酶的PS－mRNA，并测量以其为模板的蛋白质合成量(Fig.2)。在该论文中报告，在转录时制成了仅仅1种碱基用NTPαS进行取代的PS－mRNA，和4种碱基均用NTPαS进行取代的PS－mRNA，前者具有与未进行取代的mRNA(以下，有时称作“PO－mRNA”)相比合成了约2～3倍的蛋白质。本专利技术人推测，该合成效率的提高是由PS－mRNA的稳定性带来的。但是，在本文献中还报告了，4种碱基都用NTPαS进行取代的PS－mRNA，与未进行取代的相比蛋白质合成量降低(PO－mRNA的约30％)。
[0007]现有技术文献
[0008]专利文献
[0009]非专利文献1：Polyribonucleotides containing a phosphorothioate backbone.F.Eckstein,H.Gindl,Eur.J.Biochem.13,558
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564,1970；
[0010]非专利文献2：Phosphorothioate
‑
containing RNAs show mRNA activity in the prokaryotic translation systems in vitro.T.Ueda,H.Tohda,N.Chikazumi,F.Eckstein,K.Watanabe,Nucleic Acids Res.19(3),547
‑
552,1991；
[0011]非专利文献3：Efficient expression of E.coli dihydrofolate reductase gene by an in vitro translation system using phosphorothioate mRNA.H.Tohda,
N.Chikazumi,T.Ueda,K.Nishikawa,K.Watanabe,J.Biotechnol.34,61
‑
69,1994.

技术实现思路

[0012]专利技术要解决的技术问题
[0013]现有的PS－mRNA，由于NTPαS的种类和修饰数等原因，翻译效率有时升高有时降低，尚不清楚mRNA中进行什么样的PS修饰能提高翻译效率。需要说明的是，非专利文献1～3中均没有记载在非翻译区引入PS。
[0014]本专利技术的目的在于，提供一种用于蛋白质的合成、核糖体的翻译效率较高的mRNA及其制造方法。另外，本专利技术的另一目的在于，提供一种使用该mRNA提高翻译效率的蛋白质的制造装置以及蛋白质的制造方法。
[0015]解决技术问题的方法
[0016]本专利技术人，为了解决上述技术问题进行深入研究。结果发现，从5
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末端开始到起始密码子附近为止部分地引入了PS的mRNA，蛋白质的合成量增多22倍，另一方面，从起始密码子附近开始到3
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末端为止的250个碱基内引入PS的mRNA，其合成量降低了20％。基于该内容发现，从mRNA的5
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末端开始到起始密码子附近为止PS能够格外地提高翻译效率，遂完成本专利技术。
[0017]即，本专利技术是一种mRNA，该mRNA用于蛋白质的合成，其特征在于，该mRNA包括：包含起始密码子和终止密码子的翻译区；位于所述起始密码子的5
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末端侧的非翻译区，并且，至少从所述非翻译区的5
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末端开始到所述起始密码子的3
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末端侧15nt为止的范围内的一部分的磷酸基被硫代磷酸基取代。
[0018]在这种情况下，优选地，2个位点以上的所述磷酸基是所述硫代磷酸基。
[0019]进一步在这种情况下，所述非翻译区的至少一部分的所述磷酸基、和所述翻译区的至少一部分的所述磷酸基是所述硫代磷酸基。
[0020]或者，优选地，构成mRNA的一磷酸腺苷、一磷酸鸟苷、一磷酸胞苷和一磷酸尿苷中的2种以上的核苷酸是硫代磷酸基。
[0021]在上述任一种情况下，优选地，所述非翻译区包含Shine－Dalgarno序列。
[0022]在这种情况下，至少从所述非翻译区的5
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末端开始到所述起始密码子的3
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末端侧15nt为止的范围内的10个位点以上的磷酸基被硫代磷酸基取代，并且，所述Shine－Dalgarno序列和所述翻译区的双方均包含所述硫代磷酸基。
[0023]本专利技术，是如上所述的mRNA的制造方法，其特征在于，包括：配置与包含所述非翻译区和所述翻译区的所述mRNA互补的DNA模板的步骤；准备包含三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷和三磷酸尿苷的未修饰NTP，和所述未修饰NTP中的至少1种的磷酸基被硫代磷酸基取代的修饰NTP的步骤；以所述DNA模板为模板，以所述未修饰NTP和所述修饰NTP为底物通过RNA聚合酶进行转录反应的步骤。
[0024]在这种情况下，优选地，包括：将所述DNA模板中的、与从所述非翻译区的5
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末端开始到所述起始密码子的3
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末端侧15nt为止的范围对应的序列内的一处切断，得到5
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末端侧DNA片段和3
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种mRNA，用于蛋白质的合成，其特征在于，包括：包含起始密码子和终止密码子的翻译区；以及位于所述起始密码子的5
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末端侧的非翻译区，并且至少从所述非翻译区的5
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末端开始到所述起始密码子的3
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末端侧15nt为止的范围内的一部分的磷酸基被硫代磷酸基取代。2.如权利要求1所述的mRNA，其特征在于，2个位点以上的所述磷酸基是所述硫代磷酸基。3.如权利要求2所述的mRNA，其特征在于，所述非翻译区的至少一部分所述磷酸基，和所述翻译区的至少一部分的所述磷酸基是所述硫代磷酸基。4.如权利要求1所述的mRNA，其特征在于，构成mRNA的一磷酸腺苷、一磷酸鸟苷、一磷酸胞苷和一磷酸尿苷中的任意2种以上的核苷酸是硫代磷酸基。5.如权利要求1所述的mRNA，其特征在于，所述非翻译区包含Shine－Dalgarno序列。6.如权利要求5所述的mRNA，其特征在于，至少从所述非翻译区的5
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末端开始到所述起始密码子的3
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末端侧15nt为止的范围内的10个位点以上的磷酸基被硫代磷酸基取代，所述Shine－Dalgarno序列以及所述翻译区双方，均包含所述硫代磷酸基。7.一种mRNA的制造方法，是如权利要求1～6中任一项所述的mRNA的制造方法，其特征在于，包括：配制与包括所述非翻译区和所述翻译区的所述mRNA互补的DNA模板的步骤；准备包括三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷和三磷酸尿苷的未修饰NTP，以及所述未修饰NTP中的至少1种的磷酸基被硫代磷酸基取代的修饰NTP的步骤；以及以所述DNA模板为模板，以所述未修饰NTP和所述修饰NTP为底物通过RNA聚合酶进行转录反应的步骤。8.如权利要求7所述的mRNA的制造方法，其特征在于，包括：DNA切断步骤，其中，将所述DNA模板中的、与从所述非翻译区的5
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末端开始到所述起始密码子的3
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末端侧15nt为止的范围...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿部洋，阿部奈保子，
申请(专利权)人：国立研究开发法人科学技术振兴机构，
类型：发明
国别省市：