DDX5在抗病毒和调节免疫反应中的应用制造技术

本发明专利技术首次通过体内外研究发现DDX5蛋白具有明显的抗病毒和抑制免疫反应的功能，这种逃避宿主免疫反应的方式与作用是全新的，为筛选和开发新的抗病毒或调节免疫反应的药物提供了新的靶点和方法。本发明专利技术所构建的DDX5+/

【技术实现步骤摘要】
DDX5在抗病毒和调节免疫反应中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及RNA解旋酶DDX5在抗病毒和调节免疫反应中的应用。

技术介绍

[0002]RNA解旋酶DExD/H
‑
box(DDX)是目前发现最为主要的RNA结合蛋白之一,广泛存在于真核生物和大多数原核生物中,其以保守的氨基酸序列DEAD(Asp
‑
Glu
‑
Ala
‑
Asp)命名，由12个保守基序组成。N
‑
末端和C
‑
末端的非保守结构域决定了每个DDX解旋酶蛋白的特异性相互作用、亚细胞定位和表达模式宿主细胞。DDX解旋酶家族蛋白主要功能是通过结合RNA几乎调节细胞RNA代谢的全部过程，如基因转录、mRNA前体剪接、mRNA输出、核糖体生成、翻译起始、细胞器基因表达、RNA降解等，与此同时，DDX解旋酶家族蛋白已经被发现能够通过与RNA结合调控宿主细胞RNA修饰作用参与细胞的生物学过程。
[0003]DDX5蛋白又称为p68蛋白，是DDX家族特殊的成员，研究表明，它不仅参与RNA代谢过程，包括mRNA、rRNA和microRNA的加工处理、核糖体的生物合成等；也参与多种生物学过程，如细胞增殖及凋亡、胚胎发育、脂肪形成等，还参与了细胞内甲基化修饰作用。然而，目前研究最为清楚的是DDX5在肿瘤发生发展中的重要作用，研究表明，DDX5异常高表达于90％以上恶性肿瘤细胞中，它可以通过调控基因的表达及mRNA结构的变化调控基因的转录表达，研究发现，在基因组上完全缺失了DDX5的个体在胚胎发育11天的时候会由于血管发育的障碍而导致死亡，这表明，DDX5在调控宿主细胞生长发育与疾病发生具有较大的关联性。
[0004]现有对DDX5蛋白的研究及其报道主要是通过发现它在肿瘤细胞中的高表达，然而，其发生发展机理及其作用方式国内外的研究并不详细。由于DDX5的缺失对胚胎发育的致死性，国内外的学者对其在疾病发生过程中的作用尚不清楚。国外的学者为了研究该蛋白在机体发育过程中的作用，大多采用条件性缺失该基因的方式进行科学研究(条件性缺失即在小鼠发育特定的时间段或者特定的组织减低该蛋白的表达)，然而，这种方法实验稳定性差，重复率低，且操作效率较低。而采用经典的从基因组水平上敲除靶基因的可遗传的基因缺失性小鼠系是验证生物研究结论以及医学科学研究重要的动物模型，它不仅稳定性好，可无限繁殖扩群，且重复率好，已经被广泛使用于人与动物疾病的研究与产品开发中。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术的缺陷和不足，本专利技术的目的是发现DDX5蛋白的作用机理和方式，并提供其在药物筛选和开发中的应用。
[0006]本专利技术利用小干扰RNA技术及脂质体转染技术成功将鼠胚成纤维细胞中的DDX5敲减低表达及过表达，采用RNA模式病毒VSV及SeV感染细胞，检测细胞因子IFN
‑
β及IL
‑
6的表达情况，结果发现DDX5能够抑制鼠胚成纤维细胞IFN
‑
β及IL
‑
6的表达情况，表明细胞的DDX5蛋白具有抑制宿主免疫反应的功能，是重要的抗病毒靶点蛋白。本专利技术进一步采用CRISPR/
CAS9技术构建DDX5单基因敲除的小鼠DDX5
+/
‑
，采用PCR及测序技术鉴定DDX5
+/
‑
，并采用VSV病毒及SeV病毒感染小鼠，结果发现，DDX5
+/
‑
小鼠明显增强了对病毒感染的抵抗，病毒感染后，血清中IFN
‑
β及IL
‑
6的水平显著提高，靶组织内的病毒滴度显著下降，病理变化显著减低，表明DDX5是一个免疫负调控的蛋白，同时DDX5
+/
‑
小鼠是一种具有抗病毒免疫的新型小鼠系。
[0007]基于DDX5蛋白的上述功能和作用机制，本专利技术首先提供DDX5蛋白或DDX5基因在筛选抗病毒或调节免疫反应的产品中的应用。
[0008]本专利技术还提供DDX5蛋白或DDX5基因作为靶点在制备抗病毒或调节免疫反应的产品中的应用。
[0009]所述产品降低DDX5蛋白表达水平或者抑制DDX5蛋白活性。
[0010]进一步，本专利技术提供一种抗病毒或调节免疫反应的产品，其包括可以降低DDX5表达的小干扰RNA，所述小干扰RNA的核苷酸序列为：
[0011]正义链：5
‘‑
GCACAAUGGUAUGAACCAATT
‑3’
，
[0012]反义链：5
‘‑
UUGGUUCAUACCAUUGUGCTT
‑3’
。
[0013]本专利技术还提供一种抗病毒或调节免疫反应的产品，其包括可以调节DDX5基因表达的CRISPR/CAS9
‑
sgRNA载体，所述sgRNA的核苷酸序列为：
[0014]g RNA1：5
’‑
AAACAGGTTTAGCAGTCTATTGG
‑3’
，
[0015]g RNA2：5
’‑
TGCGTGCTTGTGTAGTGACTAGG
‑3’
。
[0016]另一方面，本专利技术提供一种构建DDX5单基因缺失小鼠的方法，其包括：
[0017](1)将权利要求5所述sgRNA序列构建到CRISPR/CAS9载体上；
[0018](2)从母鼠子宫内获取受精卵，将步骤1所构建的载体注射到所述受精卵的细胞核内；
[0019](3)将步骤(2)中已经注射载体的受精卵植入到母鼠子宫内，并饲养母鼠至小鼠出生；
[0020](4)检测小鼠DNA，鉴定DDX5
+/
‑
基因缺失性小鼠，并进行饲养或扩繁。
[0021]其中步骤(4)中检测小鼠DNA包括：
[0022](1)提取小鼠基因组DNA；
[0023](2)PCR扩增小鼠DDX5基因，所用引物的核苷酸序列为：
[0024]F1:5
’‑
TATCAAGAACACCCTGATTTGGCA
‑3’
，
[0025]R1:5
’‑
AAACCACATACCCATCTCTCCTCA
‑3’
；
[0026](3)检测扩增产物。
[0027]优选地，可以通过电泳或者测序等方式检测扩增产物。
[0028]本专利技术还提供所构建的DDX5
+/
‑
单基因缺失性小鼠在开发抗病毒或免疫调节药物中的应用。
[0029]本专利技术首次通过体内外研究发现DDX5蛋白具有明显的抑制免疫反应尤其是先天性免疫反应的功能，这种逃避宿主免疫反应的方式与作用是全新的，为筛选和开发新的抗病毒或调节免疫反应的药物提供了新的靶点和方法。本专利技术所构建的DDX5
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.DDX5蛋白或DDX5基因在筛选抗病毒或调节免疫反应的产品中的应用。2.DDX5蛋白或DDX5基因作为靶点在制备抗病毒或调节免疫反应的产品中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品降低DDX5蛋白表达水平或者抑制DDX5蛋白活性。4.一种抗病毒或调节免疫反应的产品，其包括可以降低DDX5表达的小干扰RNA，所述小干扰RNA的核苷酸序列为：正义链：5
‘‑
GCACAAUGGUAUGAACCAATT
‑3’
反义链：5
‘‑
UUGGUUCAUACCAUUGUGCTT
‑3’
。5.一种抗病毒或调节免疫反应的产品，其包括可以降低DDX5表达的CRISPR/CAS9
‑
sgRNA载体，所述sgRNA的核苷酸序列为：g RNA1：5
’‑
AAACAGGTTTAGCAGTCTATTGG
‑3’
，g RNA2：5
’‑
TGCGTGCTTGTGTAGTGACTAGG
...

【专利技术属性】
技术研发人员：许健，李永清，蔡云虹，江波，马振邦，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：