一种dU5`衔接子及其应用和构建的cDNA文库制造技术

本发明专利技术提供一种dU5

A du5 'adaptor and its application and construction of cDNA library

【技术实现步骤摘要】
一种dU5
’
衔接子及其应用和构建的cDNA文库


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种dU5
’
衔接子及其应用和构建的cDNA文库。

技术介绍

[0002]cDNA文库构建对很多高通量测序应用至关重要。近年来由于开发了多种cDNA文库构建方法，达到对RNA新特性的探索和研究目的，例如，RNA结构领域的研究深入。
[0003]近年来本研究团队开发了RNA G
‑
四链体结构测序(rG4
‑
seq)技术(Kwok,Marsico et al.2016)，从转录组水平揭示了RNA G
‑
四链体结构存在于人体内，为进一步研究rG4结构和功能的研究提供有效的依据，其中文库构建所用到的5
’
衔接子可以降低连接cDNA过程中的非特异结合，从而提高连接效率，此项设计已申请专利(No.9,816,120,USA,授权)。但是，rG4
‑
seq测序技术的实验流程需要的RNA起始量较大，文库构建时间长，因此我们对整个cDNA文库构建过程的一些关键实验步骤做了系统性评估与优化，希望提高文库构建的效率与质量，此项研究成果已于2019年发表(Yeung,Zhao et al.2019)，并申请了专利(No.15/957,037,USA,审中)。
[0004]基于以上研究，我们发现建库过程中PCR效率较低，完成文库的构建所需反应循环数较多，从而影响了文库的质量，导致后续二代测序分析得到的有效数据较少。因此，亟待设计一种全新的5
’
衔接子，以提高PCR扩增效率，减少PCR周期，提高文库质量，为构建广泛的生物应用cDNA文库提供一个新的重要平台。

技术实现思路

[0005]基于现有技术存在的问题，本专利技术的第一目的在于提供一种dU5
’
衔接子，该dU5
’
衔接子为专利技术人特殊设计的含脱氧尿嘧啶的结构，其能够减少接头
‑
引物二聚体的形成，提高PCR扩增效率；本专利技术的第二目的在于提供所述dU5
’
衔接子在构建cDNA文库中的应用；本专利技术的第三目的在于提供一种cDNA文库的构建方法，该构建方法中采用了本专利技术特殊设计的含脱氧尿嘧啶的dU5
’
衔接子；本专利技术的第四目的在于提供上述构建方法构建获得的cDNA文库。
[0006]本专利技术的目的通过以下技术手段得以实现：
[0007]一方面，本专利技术提供一种dU5
’
衔接子，该dU5
’
衔接子具有如下式(I)所示的结构：
[0008]5’‑
p
‑
S1
‑
S2
‑
S3
‑
S4
‑
SpC3
‑3’ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(I)
[0009]其中，S1、S2、S3和S4为依次通过化学键相连接的基因片段，p表示5
’
端进行的磷酸化修饰；S1为第一茎部；S2为环部；S3为第二茎部，其含有1个脱氧尿嘧啶dU；S1的5
’→3’
序列与S3的3
’→5’
序列互补；S4为引导部(N)
m
，其中，N选自A、T、G和C碱基中的任一种，且(N)
m
中的N相同或不同，m为10；SpC3表示3
’
端进行的C3间隔修饰。
[0010]本专利技术dU5
’
衔接子中3
’
端的引导部(N)
m
的设计和C3间隔修饰能够实现dU5
’
衔接子在与cDNA核酸样品连接过程中能够降低非特异性结合，阻止和避免自齐聚，提高连接效率。3
’
端的C3间隔修饰及5
’
端的磷酸化修饰均为本领域常规的修饰方式。
[0011]上述的dU5
’
衔接子中，优选地，所述S1具有如下所示核苷酸序列：
[0012]5’‑
AGATCGGAAGAGC
‑3’
(SEQ ID NO：1)。
[0013]上述的dU5
’
衔接子中，优选地，所述S2具有如下所示核苷酸序列：
[0014]5’‑
GTCGTGTA
‑3’
。
[0015]上述的dU5
’
衔接子中，优选地，所述S3具有如下所示核苷酸序列：
[0016]5’‑
GC/dU/CTTCCGATCT
‑3’
(SEQ ID NO：2)。
[0017]本专利技术的dU5
’
衔接子具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。
[0018]SEQ ID NO：3如下所示：
[0019]5’‑
/5Phos/
‑
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGC/dU/CTTCCGATCTNNNNNNNNNN
‑
/3SpC3/
‑3’
。
[0020]在dU5
’
衔接子的设计过程中，申请人分析原有的5
’
衔接子具有特殊的茎环结构，在后续的PCR扩增过程中可能阻碍了正向引物结合的效率，从而降低了PCR的扩增效率，因此，申请人创造性地在保证正向引物结合最大化的前提下取其临近的位置作了T
‑
dU的置换，使得dU的插入位置为自5
’
端起的第24位，此插入位更有利于后续PCR正向引物进行配对，且将其互补配对部分保留完整，有利于正向引物与模板的结合，能够有效减少接头
‑
引物二聚体的形成，降低反应所需的循环数，从而提高PCR的扩增效率，从而提高文库的质量。
[0021]另一方面，本专利技术还提供上述dU5
’
衔接子在构建cDNA文库中的应用。
[0022]由于5
’
衔接子连接步骤广泛存在于其他RNA高通量测序的文库构建过程中，因此，此项研究除了适用于rG4
‑
seq技术，亦可适用于其他基于二代测序的DNA和RNA的研究中，为构建广泛的生物应用cDNA文库提供一个新的重要平台。
[0023]再一方面，本专利技术还提供一种基于RNA
‑
G四链体测序文库构建方法改进的cDNA文库的构建方法，其改进部分包括如下步骤：
[0024]将带有3
’
衔接子的cDNA核酸样品与dU5
’
衔接子混合后进行连接反应，得到dU5
’
衔接子
‑
cDNA核酸复合物，并进行柱纯化；
[0025]对纯化后的dU5
’
衔接子
‑
cDNA核酸复合物中的脱氧尿嘧啶进行裂解，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种dU5
’
衔接子，该dU5
’
衔接子具有如下式(I)所示的结构：5
’‑
p
‑
S1
‑
S2
‑
S3
‑
S4
‑
SpC3
‑3’ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(I)其中，S1、S2、S3和S4为依次通过化学键相连接的基因片段，p表示5
’
端进行的磷酸化修饰；S1为第一茎部；S2为环部；S3为第二茎部，其含有1个脱氧尿嘧啶dU；S1的5
’→3’
序列与S3的3
’→5’
序列互补；S4为引导部(N)
m
，其中，N选自A、T、G和C碱基中的任一种，且(N)
m
中的N相同或不同，m为10；SpC3表示3
’
端进行的C3间隔修饰。2.根据权利要求1所述的dU5
’
衔接子，其中，所述S1具有如下所示核苷酸序列：5
’‑
AGATCGGAAGAGC
‑3’
(SEQ ID NO：1)；所述S2具有如下所示核苷酸序列：5
’‑
GTCGTGTA
‑3’
；所述S3具有如下所示核苷酸序列：5
’‑
GC/dU/CTTCCGATCT
‑3’
(SEQ ID NO：2)。3.根据权利要求1或2所述的dU5
’
衔接子，其中，所述dU5
’
衔接子具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。4.权利要求1～3任一项所述的dU5
’
衔接子在构建cDNA文库...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭骏杰，杨沛欣，赵洁宇，
申请(专利权)人：香港城市大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：