心肌细胞冻存方法技术

本发明专利技术提供一种心肌细胞冻存方法，心肌细胞以1.0～5.0

Myocardial cell cryopreservation method

【技术实现步骤摘要】
心肌细胞冻存方法


[0001]本专利技术涉及细胞冻存
，具体涉及一种心肌细胞的冻存方法。

技术介绍

[0002]心血管疾病每年导致大约1700万人死亡，是全球疾病死亡的主要原因，由于复杂的致病机理，心血管疾病目前难以预防。2006年日本科学家山中伸弥团队利用病毒将4个转录因子转入分化的成纤维细胞中获得了诱导多能干细胞，诱导多能干细胞技术的发展避免了胚胎干细胞遇到的伦理学问题，为相关疾病的研究和治疗提供了可能。
[0003]诱导多能干细胞具有分化成各种功能性细胞的潜能，同样地，诱导多能干细胞通过调节相应的信号通路能够产生具有收缩功能的心肌细胞，具有稳定电生理特性的心肌细胞不仅可以用于研究心脏疾病的发病机理、筛选治疗心脏疾病的药物，甚至可以开展心肌细胞治疗心脏疾病的临床研究，进一步拓展心肌细胞在心肌梗死、心脏衰竭等疾病治疗中的贡献。
[0004]心肌细胞的储存和运输是心脏疾病发病机理研究，心脏疾病治疗的前提，心肌细胞的应用离不开心肌细胞的冻存复苏。但是心肌细胞特有的电生理活性使其不同于其他干细胞或分化的细胞，目前常见的细胞冻存液有间充质干细胞冻存液、造血干细胞冻存液、免疫细胞冻存液、外周血单核细胞冻存液。目前尚未发现结合心肌细胞生理活性开发的心肌细胞冻存液。
[0005]文献Effects of Cryopreservation on Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes for Assessing Drug Safety Response Profiles披露了一种包括90％的胎牛血清以及10％的DMSO的冻存液冻存诱导多能干细胞分化的心肌细胞，但是冻存复苏后的心肌细胞的心肌收缩力降低、电生理活性相较于未经冻存的心肌细胞有不同程度的改变，说明心肌细胞经该冻存液冻存后，生理活性发生改变，严重影响了心肌细胞储存过程中的稳定性。
[0006]目前尚未发现结合心肌细胞冻存复苏后的细胞活率及电生理特性开发的心肌细胞冻存或复苏方法。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术实施例提供了一种心肌细胞冻存方法，所述心肌细胞冻存方法中，心肌细胞以1.0～5.0
×
106个细胞/mL的密度冻存于心肌细胞冻存液中，其中，所述心肌细胞冻存液包括DMSO、人血白蛋白、羟乙基淀粉和氯化钠溶液。
[0008]优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞以单细胞的形式冻存于所述心肌细胞冻存液中。
[0009]优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞冻存液包括0.5％～10％的DMSO、10％～25％的人血白蛋白、0.01～0.05g/mL的羟乙基淀粉以及0.585％～0.805％的氯化钠溶液。
[0010]进一步优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞冻存液包括10％的DMSO、20％的人血白蛋白、0.033g/mL的羟乙基淀粉以及浓度为0.63％的氯化钠溶液。
[0011]优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，，所述心肌细胞冻存液包括DMSO、人血白蛋白、羟乙基淀粉、Rock抑制剂Y27632、抗坏血酸、葡萄糖和氯化钠溶液。
[0012]进一步地，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞冻存液包括0.5％～10％的DMSO、10％～25％的人血白蛋白、0.01～0.05g/mL的羟乙基淀粉、1～10μM的Rock抑制剂Y27632、0.5～1.0g/L的抗坏血酸、2.5～7.5g/L的葡萄糖以及0.675％～0.805％的氯化钠溶液。
[0013]更进一步优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞冻存液包括10％的DMSO、20％的人血白蛋白、0.033g/mL的羟乙基淀粉、8μM的Rock抑制剂Y27632，0.8g/L的抗坏血酸、5g/L的葡萄糖以及0.9％的氯化钠溶液。
[0014]其中优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞以3.5
×
106个细胞/mL的密度冻存于心肌细胞冻存液中。
[0015]本专利技术实施例提供的心肌细胞冻存方法能够使心肌细胞在冻存12个月后仍维持较高的细胞活率及稳定的心肌细胞电生理活性，促进心肌细胞在药物药理毒理筛查及临床治疗方面的应用。
附图说明
[0016]图1为未经冻存的心肌细胞的动作电位，其中该动作电位时长为416.10
±
32.61。
具体实施方式
[0017]下面结合附图及具体实施例对本专利技术技术方案进行进一步描述，实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法，实验所用的仪器和试剂皆可通过商业途径获得。
[0018]本专利技术实施例采用的试剂来源如下：
[0019][0020][0021]实施例1心肌细胞冻存液的配制
[0022]1：配制包含90％胎牛血清以及10％DMSO的心肌细胞冻存液；
[0023]2：将0.8g羟乙基淀粉溶于70mL浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入0.3mL的DMSO和30mL的人血白蛋白；
[0024]3：将1g羟乙基淀粉溶于75mL浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别
加入0.5mL的DMSO和25mL的人血白蛋白；
[0025]4：将5g羟乙基淀粉溶于80mL浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入10mL的DMSO和10mL的人血白蛋白；
[0026]5：将1g羟乙基淀粉、0.1μmol ROCK抑制剂Y27632、0.25g葡萄糖溶于70mL浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入5mL的DMSO和25mL的人血白蛋白；
[0027]6：将5g羟乙基淀粉、1μmol ROCK抑制剂Y27632、0.75g葡萄糖溶于90mL浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入0.5mL的DMSO和10mL的人血白蛋白；
[0028]7：将3.3g羟乙基淀粉溶于70mL浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入10mL的DMSO和20mL的人血白蛋白；
[0029]8：将3.3g羟乙基淀粉、8μmol ROCK抑制剂Y27632、0.5g葡萄糖溶于70mL浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入10mL的DMSO和20mL的人血白蛋白。实施例2心肌细胞的冻存复苏方法
[0030]本专利技术实施例采用诱导多能干细胞分化的心肌细胞进行冻存液的筛选，所述诱导多能干细胞在含有CHIR99021的RPMI1640培养基中培养48h后，将培养基更换为含有IWR
‑
1的心肌细胞分化培养基，培养48h后用心肌细胞分化培养基继续培养，并每隔48h换液。培养至第8天可观察到细胞跳动。
[0031]cTnT是TNNT2基因的表达产物，是一种心肌特异型的肌钙蛋白，仅在心肌细胞中表达，因此可用作鉴定心肌细胞的特异性标志物。采用流式细胞术分析细胞cTnT的表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.心肌细胞冻存方法，其特征在于，所述心肌细胞以1.0～5.0
×
106个细胞/mL的密度冻存于心肌细胞冻存液中，其中，所述心肌细胞冻存液包括DMSO、人血白蛋白、羟乙基淀粉和氯化钠溶液。2.根据权利要求1所述的心肌细胞冻存方法，其特征在于，所述心肌细胞以单细胞的形式冻存于所述心肌细胞冻存液中。3.根据权利要求1所述的心肌细胞冻存方法，其特征在于，所述心肌细胞冻存液包括0.5％～10％的DMSO、10％～25％的人血白蛋白、0.01～0.05g/mL的羟乙基淀粉以及0.585％～0.805％的氯化钠溶液。4.根据权利要求3所述的心肌细胞冻存方法，其特征在于，所述心肌细胞冻存液包括10％的DMSO、20％的人血白蛋白、0.033g/mL的羟乙基淀粉以及浓度为0.63％的氯化钠溶液。5.根据权利要求1所述的心肌细胞冻存方法，其特征在于，所述心肌细胞冻存液包括DMSO、人血白...

【专利技术属性】
技术研发人员：张月辉，陈涛涛，王倩，王嘉显，
申请(专利权)人：南京艾尔普再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：