一种使用酯水解酶及其突变体对潜手性二酯的去对称化方法技术

本发明专利技术提供了一种使用酯水解酶及其突变体对潜手性二酯的去对称化方法，其包括如下步骤：在缓冲液中，在酯水解酶存在下，将如式II所示的化合物进行如下所示的水解反应得如式I所示的化合物即可；R1和R2分别独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；所述酯水解酶为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其突变体。以本申请中的酯水解酶催化的水解反应，条件温和、选择性高、成本低、原料转化率高、收率高且产物手性纯度高。度高。度高。

【技术实现步骤摘要】
一种使用酯水解酶及其突变体对潜手性二酯的去对称化方法


[0001]本专利技术属于酶工程
，特别涉及一种使用酯水解酶及其突变体对潜手性二酯的去对称化方法。

技术介绍

[0002]1R,2S
‑2‑
(烷氧羰基)环己烷
‑1‑
羧酸是多种临床阶段的创新药合成路线中的重要手性中间体。现有合成方法依赖化学拆分，原子经济性较低、价格较高。现有商业化酶以及天然酶，均不能产生所需1R，2S构型产物，或产生该构型的立体特异性不够高(通常<50％)。
[0003]现有技术是从1,2
‑
环己基二甲酸二甲酯出发，经过化学催化形成立体构型混合的2
‑
(烷氧羰基)环己烷
‑1‑
羧酸，在手性碱等拆分试剂的存在下，经过一次或多次重结晶，得到所需构型富集的2
‑
(烷氧羰基)环己烷
‑1‑
羧酸盐，再经过酸化得到所需构型的2
‑
(烷氧羰基)环己烷
‑1‑
羧酸。现有工艺通过手性拆分获得所需的立体构型富集的产物，这个过程中反构型的产物被丢弃，理论分离收率低于50％，实际为了得到足够高立体纯度，收率往往低于30％。工艺中需要使用当量以上的手性拆分试剂，价格昂贵，原子经济性不够高；工艺需要严格控制温度，操作较为复杂；需要大量有机溶剂，不够环保。
[0004]此外，现有文献(Baxendale I R,Ernst M,Krahnert W R等.Analogues[J].SYNLETT,2000.)中还记载了以1,2
‑
环己基二甲酸二甲酯为原料，在溶液中，以猪肝酯酶催化1,2
‑
环己基二甲酸二甲酯水解为(1R，2S)
‑2‑
(烷氧羰基)环己烷
‑1‑
羧酸，其总收率为97％，但其ee值仅为68％。因此，本领域亟需一种立体选择性高的酯水解酶及使用其对潜手性二酯的去对称方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于现有技术中的酯水解酶在催化酯水解时选择性低和收率低。为此，本专利技术提供了一种使用酯水解酶及其突变体对潜手性二酯的去对称化方法。以本申请中的酯水解酶催化的水解反应，条件温和、选择性高、成本低、原料转化率高、收率高且产物手性纯度高。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种对潜手性二酯的去对称化方法，其包括如下步骤：在缓冲液中，在酯水解酶存在下，将如式II所示的化合物进行如下所示的水解反应得如式I所示的化合物即可；
[0008][0009]R1和R2分别独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；
[0010]所述酯水解酶为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其突变体；
[0011]所述的突变体由在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中发生选自以下位点的一个或多个突变得到：第2位、第3位、第4位、第5位、第7位、第9位、第10位、第12位、第14位、第19位、第25位、第32位、第36位、第40位、第44位、第46位、第49位、第55位、第56位、第57位、第70位、第73位、第74位、第77位、第81位、第84位、第93位、第95位、第102位、第103位、第104位、第105位、第106位、第107位、第108位、第109位、第116位、第119位、第122位、第126位、第128位、第136位、第151位、第167位、第170位、第171位、第174位、第179位、第181位、第187位、第188位、第190位、第191位、第192位、、第193位、第194位、第195位、第205位、第209位、第213位、第214位、第215位、第216位、第217位、第219位、第222位、第224位、第225位、第227位、第228位、第235位、第241位、第245位、第257位、第262位、第264位、第267位、第279位、第281位、第282位、第285位、第286位、第287位、第289位、第293位、第294位、第298位、第300位、第305位、第306位、第307位、第308位、第309位、第311位、第312位、第313位、第314位、第315位、第317位、第318位、第320位、第325位、第337位、第338位、第341位、第342位、第343位、第345位、第349位、第352位、第355位、第358位、第359位、第360位、第362位、第363位、第364位、第365位、第376位、第377位、第379位、第383位、第385位、第388位、第390位、第391位、第395位、第396位、第397位、第398位、第400位、第401位、第402位、第403位、第414位、第416位、第418位、第420位、第423位、第430位、第441位、第442位、第444位、第448位、第451位、第454位、第456位、第457位、第458位、第461位、第466位、第468位、第470位、第471位、第472位、第478位和第481位。
[0012]在所述的水解反应中，所述的突变体优选由在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中发生选自以下位点的一个或多个的突变得到：第3位、第7位、第56位、第77位、第93位、第105位、第107位、第109位、第170位、第174位、第193位、第194位、第195位、第205位、第213位、第216位、第217位、第219位、第224位、第235位、第241位、第245位、第262位、第264位、第267位、第281位、第294位、第298位、第305位、第307位、第317位、第337位、第338位、第358位、第362位、第364位、第376位、第390位、第398位、第400位、第414位、第420位、第430位、第441位、第442位、第448位、第454位、第456位、第461位、第468位、第478位和第481位。
[0013]在所述的水解反应中，所述的突变体优选在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列发生选自以下的突变(即表1中的突变体2～突变体255)：217T、193E/217K/305S/481K/307A/213K、398Y/193E/217K/305S/481K/307A/213K、307A/213K/364Q、398Y/193E/217K/305S/481K/307A、224Q/217S/216P、216L/213T/224Q、213T/224Q/217S、193E/217K/305S、217K/305S、217K/305S/481K、213K、398Y/193E/217K/305S/481K、216P/362R、213T、362R、307A/213K/364Q/216L/224Q、107V/193F/194C/358V、481K/307A/213K/364Q/224Q/362R/216A、364Q、213K/364本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对潜手性二酯的去对称化方法，其特征在于，其包括如下步骤：在缓冲液中，在酯水解酶存在下，将如式II所示的化合物进行如下所示的水解反应得如式I所示的化合物即可；R1和R2分别独立地为甲基、乙基、正丙基或异丙基；所述酯水解酶为如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其突变体；所述的突变体由在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中发生选自以下位点的一个或多个突变得到：第2位、第3位、第4位、第5位、第7位、第9位、第10位、第12位、第14位、第19位、第25位、第32位、第36位、第40位、第44位、第46位、第49位、第55位、第56位、第57位、第70位、第73位、第74位、第77位、第81位、第84位、第93位、第95位、第102位、第103位、第104位、第105位、第106位、第107位、第108位、第109位、第116位、第119位、第122位、第126位、第128位、第136位、第151位、第167位、第170位、第171位、第174位、第179位、第181位、第187位、第188位、第190位、第191位、第192位、第193位、第194位、第195位、第205位、第209位、第213位、第214位、第215位、第216位、第217位、第219位、第222位、第224位、第225位、第227位、第228位、第235位、第241位、第245位、第257位、第262位、第264位、第267位、第279位、第281位、第282位、第285位、第286位、第287位、第289位、第293位、第294位、第298位、第300位、第305位、第306位、第307位、第308位、第309位、第311位、第312位、第313位、第314位、第315位、第317位、第318位、第320位、第325位、第337位、第338位、第341位、第342位、第343位、第345位、第349位、第352位、第355位、第358位、第359位、第360位、第362位、第363位、第364位、第365位、第376位、第377位、第379位、第383位、第385位、第388位、第390位、第391位、第395位、第396位、第397位、第398位、第400位、第401位、第402位、第403位、第414位、第416位、第418位、第420位、第423位、第430位、第441位、第442位、第444位、第448位、第451位、第454位、第456位、第457位、第458位、第461位、第466位、第468位、第470位、第471位、第472位、第478位和第481位。2.如权利要求1所述的去对称化方法，其特征在于，在所述的水解反应中，所述的突变体由在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中发生选自以下位点的一个或多个的突变得到：第3位、第7位、第56位、第77位、第93位、第105位、第107位、第109位、第170位、第174位、第193位、第194位、第195位、第205位、第213位、第216位、第217位、第219位、第224位、第235位、第241位、第245位、第262位、第264位、第267位、第281位、第294位、第298位、第305位、第307位、第317位、第337位、第338位、第358位、第362位、第364位、第376位、第390位、第398位、第400位、第414位、第420位、第430位、第441位、第442位、第448位、第454位、第456位、第461位、第468位、第478位和第481位。3.如权利要求2所述的去对称化方法，其特征在于，在所述的水解反应中，所述的突变体在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生选自以下的突变：217T、193E/217K/305S/481K/307A/213K、398Y/193E/217K/305S/481K/307A/213K、307A/213K/364Q、398Y/193E/217K/305S/481K/307A、224Q/217S/216P、216L/213T/224Q、213T/224Q/217S、193E/217K/305S、
217K/305S、217K/305S/481K、213K、398Y/193E/217K/305S/481K、216P/362R、213T、362R、307A/213K/364Q/216L/224Q、107V/193F/194C/358V、481K/307A/213K/364Q/224Q/362R/216A、364Q、213K/364Q/216L、307A/213K、305S/481K/307A/213K/364Q、213T/224Q、217S、217K、481K/307A/213K、193E/217K/305S/481K/307A/213K/364、481K/307A/364Q/216L/213T/224Q、305S/481K/307A/213K/364Q/224Q/362R、107V/193F/194C/205T/245Q、213K/364Q/216L/224Q/217S、224Q/217S、481K/307A、307A/364Q/216L/213T/224Q/217S、216L/213T/224Q/217S、193E、107V/193F/194C/205T/358V、481K/307A/213K/364Q/216L、213T/224Q/217T/216P/362R、216P/362R、305S/481K、217K/305S/481K/307A/213K/364Q/224Q、194C、205C、481R、267Q、468H/478A、338T/390M/414L/448K/468H、264G/267Q、337G/338T/390M/414L/448K/468H、337G/338T/390M、390M/414L/448K/468H/478A、107V/193F/194C/205T/362F、294C/337G/338T/390M/414L/448K/468H、3Q、390L、448K/468H/478A、195N/235E/241C、390M/414L/448K、376Q、338T/390M/414L/448K/468H/478A、264G/267Q/294C/337G、241C/262S、262S/264G/267Q、262S/264G/267Q/294C、294C/337G/338T/390M/414L/448K、262S/264G/267Q/294C/337G/338T、3T、317D、245Q、337G/338T/390M/414L/448K/468H/478A、414L、362T、3E/195N/235E、362F、337G、107V/193F/194C/205T/376Q、264G/267Q/294C/337G/338T/390M、193L、195N/235E/241C/262S/264G/267Q、267Q/294C/337G/338T、105P、107V、262S/264G/267O/294C/337G、235F/241C/262S/264G/267O、235E/241C/262S/264G、194T、193F/194C/205T/245Q/358V/362F/376Q、267Q/294C/337G、338T/390M/414L/448K、337G/338T/390M/414L、317G、337G/338T/390M/414L/448K、195N、262S/264G/267Q/294C/337G/338T/390M、3E/195N、481A、193F/194C/205T/245Q/358V/362F/481A、481H、241C/262S/264G/267Q/294C、390M、235E/241C、294C/337G/338T/390M、448K/468H、235E/241C/262S/264G/267Q/294C/337G、338T/390M/414L、448K、400M、420R、390M/414L、294L、264G/267Q/294C/337G/338T/390M/414L、3E/195N/235E/241C/262S/264G/267Q、235E/241C/262S/264G/267Q/294C、195N/235E/241C/262S/264G、267Q/294C/337G/338T/390M、294C/337G/338T、294C/337G/338T/390M/414L、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亚楠，孟枭，孙丰来，朱景仰，
申请(专利权)人：上海合全药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：