柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用制造技术

本发明专利技术提供了柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用，属于动物基因工程技术领域。本发明专利技术提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用。本发明专利技术设计特异性引物合成dsRNA，借助RNA干扰沉默E2J2基因，检测其基因沉默效率，后续放置在感染黄龙病菌的枝条上饲喂，探究此基因对黄龙病菌(CLas)侵染的影响。本发明专利技术通过阻断黄龙病菌在柑橘木虱体内传播途径而不是控制木虱本身，为柑橘黄龙病的有效防控提供了一种新的策略，为控制细菌类病原借助媒介昆虫的传播提供新的防控思路。借助媒介昆虫的传播提供新的防控思路。借助媒介昆虫的传播提供新的防控思路。

Application of Citrus Psylla ubiquitin binding enzyme e2j2 gene in the prevention and control of Citrus Yellow Dragon disease

【技术实现步骤摘要】
柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用


[0001]本专利技术属于动物基因工程
，尤其涉及柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用。

技术介绍

[0002]柑橘黄龙病(Huanglongbing，HLB)是世界柑橘产业中最具有毁灭性的病害之一。由于目前对黄龙病感病树体尚无有效的治疗方法，所以黄龙病又称为柑橘的“癌症”。至今黄龙病病菌仍不能进行人工培养，却能在柑橘木虱体内长期生长繁殖，柑橘木虱一旦被黄龙病菌(CLas)侵染就能够终身携带并迅速传播，这给研究黄龙病及其防控带来了巨大的困难，是近年来困扰柑橘产业的最大难题。当前国际柑橘产业对于黄龙病的控制主要局限于通过化学杀虫剂控制柑橘木虱的发生，然而化学杀虫剂的频繁使用造成了农药残留、环境污染、生物多样性被破坏和害虫的抗药性等诸多问题。因此提供一种快速和长效的控制黄龙病的新方法是十分有必要的。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用，通过阻断CLas病菌在柑橘木虱体内传播途径而不是控制木虱本身进行防控HLB。本专利技术的目的之二在于提供一种降低CLas侵染柑橘木虱的方法。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]优选的，所述E2J2基因通过降低CLas侵染柑橘木虱发挥作用。
[0007]优选的，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术还提供了一种降低CLas侵染柑橘木虱的方法，包括如下步骤：将上述的E2J2基因在柑橘木虱中进行基因沉默。
[0009]优选的，所述基因沉默为采用RNA干扰技术进行基因沉默。
[0010]优选的，所述RNA干扰技术包括如下步骤：以柑橘木虱cDNA为模板，通过PCR技术，使用扩增引物获得E2J2基因的部分片段，扩增产物连接入质粒中，以质粒为模板，用含启动子的引物进行扩增，扩增产物胶回收，合成dsRNA；稀释合成的dsRNA，饲喂柑橘木虱。
[0011]优选的，所述扩增引物为
[0012]PT
‑
F:5'ATTCAAACCACCAAGCATCT 3'，
[0013]PT
‑
R:5'TCTTCTTGTGCTCGTCTGTCT 3'。
[0014]优选的，所述含启动子的引物为
[0015]RNAi
‑
F:TAATACGACTCACTATAGGGATTCAAACCACCAAGCATCT，
[0016]RNAi
‑
R:TAATACGACTCACTATAGGGTCTTCTTGTGCTCGTCTGTCT。
[0017]优选的，所述质粒为pMD19
‑
t质粒。
[0018]优选的，饲喂的柑橘木虱为4
‑
5龄柑橘木虱若虫。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020]本专利技术首次提出柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因可用于柑橘黄龙病的防控中，通过阻断黄龙病菌在柑橘木虱体内传播途径而不是控制木虱本身，为柑橘黄龙病的有效防控提供了一种新的策略，为控制细菌类病原借助媒介昆虫的传播提供新的防控思路。
附图说明
[0021]图1为柑橘木虱泛素结合酶E2J2蛋白及其Western Blot验证图，其中左图为纯化蛋白SDS
‑
PAGE图，BSA为对照；右图为Werstern Blot验证结果，箭头指示为目的条带，一抗为鼠源抗His，M 1:Protein Marker,Bio
‑
rad,Cat.No.1610374S；M 2:Protein Marker,GenScript,Cat.No.M00521；
[0022]图2为柑橘木虱泛素结合酶E2J2体外泛素结合实验，其中M：Blue
Ⅴ
Protein Maker(10
‑
190kDa)；1为反应组别
①
；2为反应组别
②
；
[0023]图3为柑橘木虱泛素结合酶E2J2的RNAi后E2J2基因的相对表达情况，其中深色代表dsGFP处理组；浅色代表E2J2处理组；
[0024]图4为RNA干扰处理后柑橘木虱获菌情况。
具体实施方式
[0025]本专利技术提供了柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0026]在本专利技术中，所述E2J2基因优选的通过降低CLas侵染柑橘木虱发挥作用，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0027]本专利技术还提供了一种降低CLas侵染柑橘木虱的方法，包括如下步骤：将上述的E2J2基因在柑橘木虱中进行基因沉默。
[0028]在本专利技术中，所述基因沉默优选的为采用RNA干扰技术进行基因沉默。本专利技术所述RNA干扰技术优选的包括如下步骤：以柑橘木虱cDNA为模板，通过PCR技术，使用扩增引物获得E2J2基因的部分片段，扩增产物连接入质粒中，以质粒为模板，用含启动子的引物进行扩增，扩增产物胶回收，合成dsRNA；稀释合成的dsRNA，饲喂柑橘木虱。
[0029]本专利技术对于柑橘木虱的具体来源没有特殊限定，对于获得柑橘木虱的cDNA的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规获得cDNA的方法均可，在本专利技术中，优选的以柑橘木虱成虫的cDNA为模板。在本专利技术中，所述扩增引物优选为如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，具体如下：
[0030]PT
‑
F:5'ATTCAAACCACCAAGCATCT 3'，
[0031]PT
‑
R:5'TCTTCTTGTGCTCGTCTGTCT 3'。本专利技术对于PCR技术的其它条件如反应体系和反应程序没有特殊限定。使用扩增引物获得E2J2基因的部分片段后，优选的需回收扩增产物，将扩增产物连接入质粒中，所述质粒优选为pMD19
‑
t质粒，本专利技术对于pMD19
‑
t质粒的具体来源没有特殊限定。将扩增产物连接入质粒中后，优选的需转化至大肠杆菌感受态细胞Trans5α，涂平板，挑单菌落于含氨苄青霉素的LB液体培养基中扩摇，对菌液进行测序，选
取突变率低的菌液扩摇并提取质粒；以质粒为模板，用含启动子的引物进行扩增，扩增产物胶回收。在本专利技术中，所述含启动子的引物优选为含有T7启动子的引物序列，所述含有T7启动子的引物序列优选为如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，具体如下：
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用，其特征在于，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述E2J2基因通过降低CLas侵染柑橘木虱发挥作用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种降低CLas侵染柑橘木虱的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的E2J2基因在柑橘木虱中进行基因沉默。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因沉默为采用RNA干扰技术进行基因沉默。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RNA干扰技术包括如下步骤：以柑橘木虱cDNA为模板，通过PCR技术，使用扩增引物获得E2J2基因的部分片段，扩增产物连接入质粒中，以质粒为模板，用含启动子的引物进行扩增，扩增产物胶回收，合成...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢占军，曾祥东，张金波，余海中，方瑜婕，胡威，陈玮，黄爱军，彭婷，姚锋先，邹小金，谢廉颉，汪和贵，舒佳旺，刘淑婷，
申请(专利权)人：赣南师范大学，
类型：发明
国别省市：