一种快速检测人乳头瘤病毒核酸型别的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种快速检测人乳头瘤病毒核酸型别的方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明专利技术提供的方法主要利用引物SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测人乳头瘤病毒核酸型别的方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种快速检测人乳头瘤病毒核酸型别的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]HPV病毒是人类乳头瘤病毒的缩写，是一种乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒感染引起的一种性传播疾病，主要类型为HPV1、2、6、11、16、18、31、33及35型等，HPV16和18型长期感染可能与女性宫颈癌有关。
[0003]人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，简称HPV)是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性，长期以来，已知HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。像乙肝病毒一样，HPV也是一种DNA病毒。
[0004]目前最常用的病毒核酸特异基因检测法主要有恒温扩增
‑
金探针层析法、实时荧光PCR法和基因芯片检测法。
[0005]1.RNA恒温扩增
‑
金探针层析法
[0006]采用恒温扩增的方式对产物进行扩增，扩增产物后加入30ul新型冠状病毒检查液中，与特异探针杂交，最后将混合液全部滴加至检测卡样孔内，通过层析显色读取结果。此方法成本相对较低，但是试剂卡一个卡片只能区分一种型别，如果像HPV病毒检测20多种型别的情况下，需要制作20多种试剂卡，会导致成本大幅上升，操作复杂。
[0007]2.实时荧光PCR
[0008]实时荧光PCR是一种快速简便、成本相对较低、且已在临床广泛使用的感染性病原体核酸检测技术。该方法采用多通道荧光检测技术，可以将20多种型别做到6
‑
8只管进行分型检测，虽然也可以检测，但是荧光探针成本相对较高，多管检测成本提高，操作也不方便。
[0009]3、传统基因芯片检测方法
[0010]首先经过PCR扩增，将HPV核酸片段进行扩增，扩增后产物加到基因芯片上进行杂交，经过洗脱等过程之后，采用荧光扫描仪或阅读仪进行读片，得到HPV型别信息。生物芯片杂交检测方法具有检测灵敏度高、特异性高，在同一张芯片上检测通量高的特点。但是通过芯片进行检测，首先要对检测样本的特定片段核酸进行扩增，经过扩增后产物放在基因芯片上杂交，PCR扩增过程一般经过40个循环，时间在1.5小时左右，耗时较长，并且PCR过程需要特定的PCR扩增设备，为了防止污染，还需要在专门的环境下进行，设备和环境成本相对较高。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的之一在于提供一种人乳头瘤病毒型别鉴定的RPA引物和RPA探针，所述引物包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；所述RPA探针如SEQ ID NO.5
‑
28所示。
[0012]本专利技术的目的之二在于提供一种检测人乳头瘤病毒型别的试剂盒，所述试剂盒包括上述RPA引物和RPA探针。
[0013]优选地，所述试剂盒还包括RPA反应管、阳性对照模板、阴性对照模板中的至少一种。
[0014]本专利技术的目的之三在于提供一种检测人乳头瘤病毒型别的方法，所述方法包括以下步骤：
[0015](1)提取样本中的DNA；
[0016](2)以步骤(1)提取的DNA为检测模板，采用权利要求1所述的RPA引物进行RPA扩增反应；
[0017](3)将扩增后的产物分为若干份，再分别加入不同的RPA探针进行杂交；
[0018](4)分析RPA扩增产物。
[0019]优选地，所述步骤(2)中RPA扩增反应的体系为50μL，具体如下表所示：
[0020]体系组成体积(uL)BufferA20BufferB20引物F(10umol/ml)2引物R(10umol/ml)2模板2.5Buffer C2.5
[0021]最后使用ddH2O补足至50μL；
[0022]Buffer A包括20％PEG35000、10％海藻糖、250mM磷酸肌酸、12.5mM二硫苏糖醇、250mM Tris
‑
HCl、12.5mM dNTPs和5mM ATP；
[0023]Buffer B为500ng recA重组酶、360ng单链结合蛋白、25ng磷酸激酶、150ng BSU聚合酶50ng M
‑
MLV逆转录酶和75ng大肠杆菌外切酶Ⅲ；
[0024]Buffer C为280mM醋酸镁溶液。
[0025]更优选地，所述步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为37
‑
45℃下反应25
‑
35min。
[0026]更优选地，所述步骤(3)的具体操作为：
[0027]1)取10ul扩增产物至生物芯片检测区；
[0028]2)取100ul杂交缓冲液于芯片上，在45℃反应30分钟；所述杂交缓冲液为：5
×
SSC缓冲液，SDS浓度0.4％，TX
‑
100浓度0.2％；
[0029]3)用预热的0.01
‑
0.1N NaOH溶液洗涤3次，每次5
‑
10s；
[0030]4)将芯片置于50℃0.1
×
SSC中洗涤1min，空气吹干芯片表面；
[0031]5)取BW反应液100ul于芯片上，室温反应10分钟；所述BW反应液包括1
×
SSC和浓度0.2mg/L为HRP的配体；
[0032]6)用0.1
×
SSC溶液清洗3次，每次1分钟，空气吹干芯片表面；
[0033]7)取100ul TMB显色液于芯片表面，反应5分钟；
[0034]8)用0.1
×
SSC溶液清洗3次，每次1分钟，离心甩干芯片表面残余液体并拍照分析。
[0035]20
×
ssc的配方为：氯化钠3M(175g/L)、柠檬酸钠0.3M(88g/L)；
[0036]TMB即3，3
′
，5，5
′‑
Tetramethylbenzidine，是辣根过氧化物酶的常用底物，在辣根
过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。
[0037]更优选地，所述步骤(8)的分析过程为：每个HPV型别探针反应体系设置3个复点，3个点是一样的，其中3个点中至少2个显示为阳性，则认定分型检测结果有效。芯片上HPV各型别对应位置3个点中，至少两个信号点出现阳性信号即可判断为阳性。
[0038]本专利技术的目的之四在于提供上述RPA引物和RPA探针在制备人乳头瘤病毒型别鉴定试剂中的应用。
[0039]RPA原理介绍：重组酶与引物结合形成的蛋白
‑
DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人乳头瘤病毒型别鉴定的RPA引物和RPA探针，其特征在于，所述引物包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；所述RPA探针如SEQ ID NO.5
‑
28所示。2.一种检测人乳头瘤病毒型别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1中的RPA引物和RPA探针。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RPA反应管、阳性对照模板、阴性对照模板中的至少一种。4.一种检测人乳头瘤病毒型别的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样本中的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA为检测模板，采用权利要求1所述的RPA引物进行RPA扩增反应；(3)将扩增后的产物分为若干份，再分别加入不同的RPA探针进行杂交；(4)分析RPA扩增产物。5.根据权利要求4所述的检测人乳头瘤病毒型别的方法，其特征在于，所述步骤(2)中RPA扩增反应的体系为50μL，具体如下表所示：体系组成体积(uL)BufferA20BufferB20引物F(10umol/ml)2引物R(10umol/ml)2模板2.5Buffer C2.5最后使用ddH2O补足至50μL；Buffer A包括20％PEG35000、10％海藻糖、250mM磷酸肌酸、12.5mM二硫苏糖醇、250mM Tris
‑
HCl、12.5mM dNTPs和5mM ATP；Buffer B为500ng recA重组酶、360ng单链结合蛋白、25ng磷酸激酶、150ng BSU聚合酶50ng M
‑
MLV逆转录酶和75ng大肠杆菌外切酶Ⅲ；Buffer C为280mM醋酸镁溶液。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋家武，肖杰，王丽玲，胡荣，
申请(专利权)人：珠海赛乐奇生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：