一种敲低SNX10基因的shRNA、慢病毒载体、乳腺癌细胞及应用制造技术

本申请公开了一种用于敲低SNX10基因表达的shRNA，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本申请还提供一种含有上述shRNA的慢病毒载体；本发明专利技术还提供一种乳腺癌细胞；本发明专利技术还提供上述shRNA、慢病毒载体、乳腺癌细胞在制备治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。本发明专利技术观察了下调SNX10基因表达的shRNA对三阴性乳腺癌MDA

ShRNA, lentivirus vector, breast cancer cell with snx10 gene knocked down and its application

【技术实现步骤摘要】
一种敲低SNX10基因的shRNA、慢病毒载体、乳腺癌细胞及应用


[0001]本申请涉及分子生物学
，特别是涉及一种敲低SNX10基因的shRNA、慢病毒载体、乳腺癌细胞及应用。

技术介绍

[0002]乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一。据2020年全球癌症统计报告记载，乳腺癌新发病例约230万例，其总发病率(11.7％)居全球癌症发病榜首。三阴性乳腺癌约占所有乳腺癌的15％，由于其ER、PR和HER2均无表达，限制了现有乳腺癌治疗方法的有效性，导致其预后差、复发转移率高、死亡率高。
[0003]分选蛋白SNX10是含有phox同源结构域的磷酸肌醇结合蛋白家族的成员，在细胞内定位于内体，参与调节内体稳态。目前关于SNX10的功能研究主要集中在结直肠癌等癌症发展、骨骼疾病、心血管疾病、代谢紊乱以及自噬等。在乳腺癌中，还未见相关研究报道。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术首先为提供一种用于敲低SNX10基因表达的shRNA；本专利技术还提供一种含有上述shRNA的慢病毒载体；本专利技术还提供一种乳腺癌细胞；本专利技术还提供上述shRNA、慢病毒载体、乳腺癌细胞在制备治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。
[0005]本专利技术提供的技术方案如下：
[0006]一种用于敲低SNX10基因表达的shRNA，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。具体为：CCGGGCTTTGTTACCCAGCCTAATTCTCGAGAATTAGGCTGGGTAACAAAGCTTTTT。
[0007]含有上述shRNA的慢病毒载体。
[0008]优选地，所述慢病毒载体的RNA干扰靶序列如SEQ ID No.2所示。具体为：TTTGTTACCCAGCCTAATT。
[0009]一种乳腺癌细胞，所述乳腺癌细胞为感染上述慢病毒载体的乳腺癌细胞。
[0010]上述shRNA、上述慢病毒载体、上述乳腺癌细胞，在制备治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。
[0011]优选地，所述药物可抑制三阴性乳腺癌细胞生长和肿瘤发展。
[0012]本专利技术公开了下调SNX10基因表达的shRNA(shSNX10)在三阴性乳腺癌细胞生长及肿瘤发展中的应用。本专利技术观察了下调SNX10基因表达的shRNA对三阴性乳腺癌MDA
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231细胞生长的影响，并结合裸鼠成瘤实验；通过Celigo细胞计数法、克隆形成实验和MTT实验证实，使用shSNX10后，细胞的增殖受到显著抑制；动物实验证明，敲低SNX10能够有效抑制肿瘤的生长；SNX10可作为治疗三阴性乳腺癌的靶点；进一步以SNX10为靶点设计和开发用于治疗三阴性乳腺癌的抗肿瘤药物。
[0013]三阴性乳腺癌对乳腺癌的标准治疗不敏感，缺乏靶点，而申请人通过研究发现shSNX10可显著抑制三阴性乳腺癌MDA
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231细胞的生长，并能抑制其裸鼠皮下移植瘤的发生发展。因此，SNX10可作为治疗三阴性乳腺癌的基因和抗肿瘤药物的靶点。可采用将
oligo。
[0030]SEQ ID NO.1：CCGGGCTTTGTTACCCAGCCTAATTCTCGAGAATTA GGCTGGGTAACAAAGCTTTTT
[0031](3)选取GV115(上海吉凯公司)作为载体，加入AgeI和EcoRI限制酶使其线性化，利用T4 DNA Ligase(Fermentas公司)连接双链DNA oligo与线性化的GV115载体。将重组载体转化TOP10大肠杆菌感受态细胞(TIANGEN公司)，涂布平板培养，选取阳性克隆利用以下引物进行PCR鉴定，最后通过测序进行验证。(鉴定引物
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F：CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA；鉴定引物
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R：GTAATACGGTTATCCACGCG)
[0032](4)将测序正确的菌液进行扩增、质粒抽提，将质检合格的质粒送上海吉凯基因公司进行慢病毒包装。其中shCtrl表示阴性对照病毒，shSNX10为SNX10干扰慢病毒。
[0033]实施例2：MDA
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231细胞培养、慢病毒感染
[0034]三阴性乳腺癌细胞系MDA
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231的培养基成分为：DMEM/F12培养基(Gibco)，同时添加10％的胎牛血清(Gibco)，100μg/mL的双抗(青霉素/链霉素)；在37℃，含5％CO2的细胞培养箱中培养。当细胞密度约30％左右，按照MOI＝5分别加入shSNX10干扰慢病毒或者shCtrl阴性对照病毒，感染细胞12小时后换液。
[0035]实施例3：建立shSNX10稳定转染细胞系MDA
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231
[0036]慢病毒感染细胞72小时后，加入嘌呤霉素(终浓度为4μg/mL)，待48小时后，将细胞进行传代操作，待贴壁后继续加入嘌呤霉素进行筛选。收集细胞提取RNA，逆转成cDNA后通过RT
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qPCR实验检测mRNA表达水平(附图1)，冻存细胞，备用。
[0037]其中SNX10及GAPDH的引物序列见表1
[0038]表1
[0039][0040][0041]实施例4：shSNX10对MDA
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231细胞生长的影响
[0042]Celigo细胞计数实验：在96孔板中接种1000个MDA
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231细胞，24小时后，通过Celigo进行细胞计数，每隔24小时检测一次，每次3个复孔，直至120小时。绘制生长曲线，可发现，与shCtrl相比，shSNX10可显著抑制MDA
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231细胞的生长(附图2
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3)。
[0043]克隆形成实验：在6孔板中接种800个MDA
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231细胞，每组3个复孔，每隔3天进行换液。20天后，加入4％多聚甲醛固定细胞，PBS清洗后，加入GIEMSA染色液(上海鼎国生物)染色，清水漂洗后晾干，拍照记录并统计。与shCtrl相比，shSNX10可显著抑制MDA
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231细胞的克隆形成能力(附图4
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5)。
[0044]MTT实验：在96孔板中接种2000个MDA
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231细胞，24小时后，加入MTT孵育4小时，
弃培基后加入DMSO，检测OD490。每隔24小时检测一次，每次5个复孔，直至120小时。绘制生长曲线，可发现，与shCtrl相比，shSNX10可显著抑制MDA
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231细胞的增殖(附图6)。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于敲低SNX10基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.含有权利要求1所述的shRNA的慢病毒载体。3.根据权利要求2所述的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体的RNA干扰靶序列如SEQ ID No.2所示。4.一种乳腺癌细胞，...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟警，祖旭宇，郭银平，刘江华，文格波，
申请(专利权)人：南华大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：