一种褐藻胶裂解酶ALyI1及其应用制造技术

本发明专利技术从海参肠细菌Tamlanasp.中克隆的褐藻胶裂解酶ALYI1(32.15kDa)。ALYI1，属于多糖裂解酶7家族，该酶在40℃、pH 8.6条件下活性最佳，表现出显著的耐盐性，在0.0

Alginate lyase alyi1 and its application

【技术实现步骤摘要】
一种褐藻胶裂解酶ALyI1及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种褐藻胶裂解酶及其应用。

技术介绍

[0002]绿脓杆菌是一种革兰氏阴性细菌，可引起植物和动物的机会性感染。除了在住院患者中引起医院获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎外，铜绿假单胞菌在呼吸系统受损的囊性纤维化患者中尤其严重。由于铜绿假单胞菌精细的适应机制，包括生物膜形成、对抗生素产生的抗性、基因组可塑性、超突变性以及在感染的不同阶段产生各种毒性阶段，因此在感染后从囊性纤维化患者的肺中根除铜绿假单胞菌非常困难。铜绿假单胞菌的生物膜包含胞外多糖、Pel、Psl和褐藻胶。Pel由N
‑
乙酰半乳糖胺和N
‑
乙酰氨基葡萄糖组成。Psl由半乳糖和甘露糖组成。
[0003]褐藻胶是一种线性酸性多糖，是褐藻(如褐藻科)细胞壁和细胞内物质的重要组成部分。在结构上，它由α
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L
‑
古洛糖醛酸盐(G)和β
‑
D
‑
甘露糖醛酸盐(M)组成，通过1，4
‑
糖苷键连接，这两种糖单元可以按照三种模式进行组合:聚古洛糖醛酸(polyG)、聚甘露糖醛酸(polyM)和杂聚物嵌段(poly MG)。
[0004]褐藻胶裂解酶具有多种来源，包括海洋和陆地细菌、真菌、病毒、褐藻、海洋软体动物和棘皮动物。在过去的几年里，已经鉴定了许多来自细菌的褐藻胶裂解酶。根据碳水化合物活性酶(CAZy)数据库，已对14个多糖裂解酶(PL)家族(PL5、6、7、8、14、15、17、18、31、32、34、36、39和41)进行了分类，最大的褐藻胶裂解酶家族为PL7家族。
[0005]褐藻胶裂解酶是通过β
‑
消除反应降解褐藻胶，产生不饱和产物的酶。按催化方式进行分类，褐藻胶裂解酶可分为内切型和外切型。褐藻胶裂解酶可用于研究褐藻胶的精细结构，生产特定长度的polyM和polyG嵌段或褐藻胶寡糖，用于农业、生物技术和医学工业中的特定应用，以及生产用于生物燃料生产的单糖。褐藻胶裂解酶也被探索作为囊性纤维化的生物治疗剂，因为它们可以通过清除生物膜基质中的褐藻胶来增加抗生素的效率。
[0006]本研究从海洋细菌Tamlanasp.I1中分离纯化了一种新的褐藻胶裂解酶。报道了其相关生化特性和对铜绿假单胞菌生物膜的作用能力。该酶具有良好的耐盐性。

技术实现思路

[0007]一方面，本专利技术提供了一种褐藻胶裂解酶，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列与SEQIDNo.2相比，具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
[0008]在一个实施方式中，所述褐藻胶裂解酶来源于海洋细菌Tamlanasp.，例如，海洋细菌Tamlanasp.I1。
[0009]在一个实施方式中，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列与SEQIDNo.2相比具有至少99％的序列同一性，并且来源于海洋细菌Tamlanasp.I1。
[0010]在优选的实施方式中，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
[0011]另一方面，本专利技术还提供了褐藻胶裂解酶的编码基因，优选的，所述基因的序列如
SEQ ID No.1所示。
[0012]另一方面，本专利技术还提供了包含上述编码基因的重组载体，所述重组载体优选为重组表达载体，如pET系列的载体，例如pET
‑
22b；又如，pRSFDuet
‑
1载体。
[0013]另一方面，本专利技术还提供了包含上述重组载体的重组菌株，优选的，所述重组菌株为大肠杆菌，如，大肠杆菌BL21。
[0014]另一方面，本专利技术还提供了上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株在降解褐藻胶中的应用。
[0015]在一个实施方式中，所述褐藻胶包括海藻酸钠。
[0016]另一方面，本专利技术还提供了一种降解褐藻胶的方法，所述方法包括利用上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株对褐藻胶进行处理的步骤。
[0017]在一个实施方式中，所述处理的温度为30℃
‑
60℃，如，35℃、40℃或50℃；pH为5
‑
11，如，pH为6、7、8、8.6、9、10或11。
[0018]在一个实施方式中，所述处理的盐浓度为10mM
‑
5000mM，例如，1000mM、2000mM、2500mM、3000mM或4000mM；优选的，所述盐浓度为NaCl浓度。
[0019]另一方面，本专利技术还提供了上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株在抑制微生物生物膜中的用途。优选的，所述生物膜为微生物以褐藻胶为基质形成的生物膜。
[0020]另一方面，本专利技术还提供了一种抑制微生物生物膜的制剂，所述制剂包括上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株。
[0021]另一方面，本专利技术还提供了上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株在制备用于抑制微生物生物膜的制剂中的用途。
[0022]在一个实施方式中，所述微生物为铜绿假单胞菌。
[0023]另一方面，本专利技术还提供了上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株在抑制铜绿假单胞菌中的应用，或在制备用于抑制铜绿假单胞菌的制剂中的用途。
[0024]在一个实施方式中，本专利技术还提供了上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株在制备用于治疗或缓解由铜绿假单胞菌引起的疾病的药物中的用途。
[0025]另一方面，本专利技术还提供了一种处理铜绿假单胞菌生物膜的方法，所述方法包括利用上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株对所述生物膜进行处理的步骤。
[0026]在一个实施方式中，所述处理的温度为30℃
‑
60℃，如，35℃、40℃或50℃；pH为5
‑
11，如，pH为6、7、8、8.6、9、10或11。
[0027]在一个实施方式中，所述处理的盐浓度为10mM
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5000mM，例如，1000mM、2000mM、2500mM、3000mM或4000mM；优选的，所述盐浓度为NaCl浓度。
附图说明
[0028]图1为rAlyI1的表达、纯化。(A)褐藻胶裂解酶活性的检测。(1)纯化蛋白，(2)诱导组蛋白，(3)空载体对照，(4)非诱导对照；(B)重组rAlyI1表达和纯化的SDS
‑
PAGE分析。泳道M，蛋白质标记；泳道1，重组蛋白；泳道2，纯化的rAlyI1。
[0029]图2为rAlyI1的生化特征。(A)rAlyI1在不同温度(4
‑
70℃)下的相对活性。(B)rAlyI1的热稳定性。(C)最佳反应pH(D)pH稳定性。(E)金属离子的影响。(F)NaCl的影响。数据显示为平均值
±
标准偏差，n＝3。
[0030]图3为分析底物特异性和最终产物。(A)rAlyI1的底物特异性。(B)TLC分析的最终产品。泳道1
‑
3，纯化的单糖、二糖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种褐藻胶裂解酶，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列与SEQ ID No.2相比，具有至少95％的序列同一性。2.编码权利要求1所述褐藻胶裂解酶的基因。3.包含权利要求2所述基因的重组载体。4.包含权利要求3所述重组载体的重组菌株。5.权利要求1所述的褐藻胶裂解酶、或权利要求2所述的基因、或权利要求3所述的重组载体、或权利要求4所述的重组菌株在降解褐藻胶中的应用。6.一种降解褐藻胶的方法，所述方法包括利用权利要求1所述的褐藻胶裂解酶、或权利要求2所述的基因、或权利要求3所述的重组载体、或权利要求4所述的重组菌株对褐藻胶进行处理的步骤。7.权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：周燕霞，张铭静，贠帅婷，彭力阳，马雨，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：