一种植物乳杆菌检测的引物探针组合、RPA检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种用于植物乳杆菌检测的引物探针组合，其特征在于，所述上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2所示，基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的。本发明专利技术提供的引物探针针对植物乳杆菌基因组保守区域设计并经过筛选，具有良好的特异性和灵敏度，检出限低。检出限低。检出限低。

【技术实现步骤摘要】
一种植物乳杆菌检测的引物探针组合、RPA检测试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种用于植物乳杆菌检测的引物探针组合、RPA检测试剂盒以及检测方法。

技术介绍

[0002]乳杆菌为革兰氏阳性、厌氧或兼性厌氧、无芽孢杆菌，在自然界中分布广泛。植物乳杆菌是乳杆菌的一种，与其他乳杆菌相比，该菌活性较高，能大量产酸。科学研究表明，植物乳杆菌对多种致病菌具有抑制作用，它通过与病原菌竞争限制性营养素来抑制病原菌生长，还通过其生产的乳酸、双乙酰等物质对其他细菌产生作用，调节肠道菌群之间的关系以及微生态的组成。作为一种益生菌，植物乳杆菌还具有多种保健作用，如调节免疫功能、促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐受症、抑制肿瘤细胞形成和降低血清胆固醇从而预防心血管疾病等。此外，植物乳杆菌还广泛应用于食品发酵、生物防腐等领域，是一种新型的绿色添加剂。相关产业具有广阔的应用前景。
[0003]目前，常规益生菌检测主要通过生化反应和选择性培养计数等方法进行，不够快速准确，限制了益生菌产品的发展和应用。随着分子生物学技术的快速发展，以序列扩增为基础的核酸检测方法得到广泛应用。其中，重组酶聚合酶扩增(RPA)技术具有成本低、速度快、灵敏度高等优势，将该技术应用于植物乳杆菌检测，能够减少检测成本、简化实验流程、提高结果准确率，为益生菌产业发展助力。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术上的问题，本专利技术提供一种用于植物乳杆菌检测的引物探针组合、RPA检测试剂盒以及检测方法，特异性强，灵敏度高，重复性好，简化检测步骤、提高检测效率。
[0005]本专利技术提供以下技术方案：
[0006]一种用于植物乳杆菌检测的引物探针组合，所述上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2所示，基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的。
[0007]进一步的，上、下引物应用于PCR反应中的终浓度为0.4μM，荧光探针应用于PCR反应中的终浓度为0.12μM。
[0008]进一步的，所述SEQ ID NO.3即荧光标记探针序列5
’
端起第34位碱基标记FAM荧光基团，第35位为无碱基位点，第37位碱基标记BHQ1猝灭基团。
[0009]一种将引物探针组合用于植物乳杆菌RPA检测试剂盒的应用。
[0010]一种采用引物探针组合的植物乳杆菌RPA检测试剂盒，包括权利要求1所述的引物探针组合，还包括快速核酸释放剂、缓冲液体系A、缓冲液体系B和干粉反应管。
[0011]进一步的，所述快速核酸释放剂包括质量浓度为1mg/mL～20mg/mL的溶菌酶、体积百分比为1％～5％的聚乙二醇、摩尔浓度为0.5mM～5mM的二硫苏糖醇和摩尔浓度为1mM～
10mM的Tris
‑
HCl。
[0012]进一步的，所述缓冲液体系A包括PEG
‑
6000和无核酸酶水，所述缓冲液体系B包括醋酸镁和无核酸酶水，所述干粉反应管包含单链DNA结合蛋白、重组酶、链置换DNA聚合酶、海藻糖、PEG
‑
6000和dNTPs。
[0013]一种利用植物乳杆菌RPA检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
[0014](1)将待测样本与快速核酸释放剂充分混合，核酸释放剂与样本的混合比例为3：3～20，混合物于25℃～95℃孵育1～10min，完成核酸释放；
[0015](2)向每个反应管中依次加入29.4μL缓冲液体系A、2μL上游引物、2μL下游引物、0.6μL荧光探针和8.5μL无核酸酶水；
[0016](3)向每个反应管中加入5μL样本与核酸释放剂的混合物；
[0017](4)向每个反应管中加入2.5μL缓冲液体系B，混匀并离心后，进行上机检测，反应程序为：42℃反应20min，每30s读取一次荧光值，判断植物乳杆菌是否检出。
[0018]进一步的，步骤(4)中先判断扩增过程中是否产生指数扩增曲线，未产生指数扩增曲线则判定为阴性；
[0019]产生指数扩增曲线，按照下表进行判读：
[0020]。
[0021]采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：
[0022]1、本专利技术提供的引物探针针对植物乳杆菌基因组保守区域设计并经过筛选，具有良好的特异性和灵敏度，检出限低。
[0023]2、本专利技术的快速核酸释放剂只需与样本简单混合后孵育，即可完成样本核酸释放过程，提高了提取效率，减少了试剂和样品用量，简化了操作步骤，降低了人工成本，具有高效率，低成本，高质量等优点。处理后的样本无需进一步纯化，可直接用于RPA检测。
[0024]3、本专利技术提供的植物乳杆菌检测方法将等温RPA检测技术与快速核酸释放剂结合，可在30分钟左右完成从样本到结果的检测全流程，大幅提高了检测效率。
附图说明
[0025]图1为使用本专利技术的试剂盒进行植物乳杆菌检测的特异性测定的结果示意图。
[0026]图2
‑
4为使用本专利技术的试剂盒进行植物乳杆菌检测的灵敏度测定的三次结果示意图。
[0027]图5为为使用本专利技术的试剂盒进行植物乳杆菌检测的重复实验结果示意图。
具体实施方式
[0028]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0029]实施例1
[0030]本专利技术提供了一种植物乳杆菌检测的引物探针组合，根据NCBI数据库提供的植物乳杆菌全基因组序列，通过BLAST比对,选择保守特异性序列作为检测靶标，如SEQ ID No.4所示，序列如下：
[0031]5’‑
ATGCCATTTAATGGTTATCAGACGTATTATCGAATCGTAGGGGATCGGCAATCAAATAAGACACCGTTAGTTTTGCTACATGGTGGTCCAGGATCAACGCATAATTACTTTGAAGGATTTGATGACCTGGCCGTTCAAACGGGACGACCAATCGTCATGTATGATCAATTAGGCTGTGGGCGTTCATCGATACCTGATGACGATCAATTATGGCAAGCCGCAACGTGGGTGGCAGAGTTACAGGCGTTACGTACGTATTTAGACTTACCCGAGATTCACTTACTAGGGCAGTCCTGGGGTGGTATGCTAGCTATTATTTATGGTTGTGACTATCGACCACAGGGGATTAAAAGTTTGATTTTAGCCAGTACCTTGTCTTCAGCCCGACTGTGGGCTCAGGAACAGCATCGGATGATTCGGTTAATGTCCCCAGCGGATTAGTCGGCTATTGCGACAGCAGAACGGTTACAGGATTTCACAGGTGCTGCCTACCTGACTGCTAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于植物乳杆菌检测的引物探针组合，其特征在于，所述上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2所示，基因探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，上、下引物应用于PCR反应中的终浓度为0.4μM，荧光探针应用于PCR反应中的终浓度为0.12μM。3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述SEQ ID NO.3即荧光标记探针序列5
’
端起第34位碱基标记FAM荧光基团，第35位为无碱基位点，第37位碱基标记BHQ1猝灭基团。4.一种将权利要求1所述的引物探针组合用于植物乳杆菌RPA检测试剂盒的应用。5.一种采用权利要求1所述的引物探针组合的植物乳杆菌RPA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合，还包括快速核酸释放剂、缓冲液体系A、缓冲液体系B和干粉反应管。6.根据权利要求5所述的植物乳杆菌RPA检测试剂盒，其特征在于，所述快速核酸释放剂包括质量浓度为1mg/mL～20mg/mL的溶菌酶、体积百分比为1％～5％的聚乙二醇、摩尔浓度为0.5mM～5mM的二硫苏糖醇和摩尔浓度为1mM～10mM的Tris
‑
HCl。7.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵可心，马雪征，刘莹莹，胡孔新，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：