视网膜色素变性疾病动物模型的构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种视网膜色素变性动物模型的构建方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术公开的构建方法利用CRISPR/Cas9技术使目标动物的Rho基因发生突变，进而使其编码的Rho蛋白具有突变。本发明专利技术首次得到了基于Rho基因发生L125R突变的疾病动物模型，其具有视网膜色素变性的表现或症状，为视网膜色素变性的病理生理机制研究、筛选相关基因治疗药物研究等提供了动物模型基础。等提供了动物模型基础。等提供了动物模型基础。

Construction method and application of animal model of retinitis pigmentosa disease

【技术实现步骤摘要】
视网膜色素变性疾病动物模型的构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体而言，涉及视网膜色素变性动物模型的构建方法和应用。

技术介绍

[0002]视网膜视杆细胞内视蛋白与由维生素A氧化而形成的11
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顺视黄醛结合形成Rho。在光照下11
‑
顺视黄醛转变为全
‑
反视黄醛，此为视觉形成的第一步。Rho突变往往导致常染色体显性遗传的视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)。RP是一种世界范围内常见的遗传性视网膜变性疾病，以视网膜视杆细胞和视锥细胞进行性丧失，并导致严重的视力障碍，最终导致双眼失明为主要表现；其不仅影响患者本身的生活和生存质量，也给家庭成员带来巨大的精神和经济负担。由于RP遗传的异质性，患者的发病年龄、进展速度及遗传方式也各有差异。目前该疾病的病理生理机制尚未完全阐明，正在进行或已完成临床试验的RP疗法以基因治疗为主。但目前没有Rho c.374T>G突变位点为基础的RP动物模型建立。
[0003]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种视网膜色素变性动物模型的构建方法和应用。通过本专利技术的构建方法首次得到了基于Rho基因L125R突变的视网膜色素变性动物模型，该疾病动物模型具有视网膜色素变性的表现或症状，为视网膜色素变性的病理生理机制研究、筛选相关基因治疗药物研究等提供了动物模型基础。
[0005]本专利技术是这样实现的：
[0006]一方面，本专利技术提供一种基于Rho基因突变的视网膜色素变性动物模型的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术使目标动物的Rho基因发生突变：c.374T>G，进而以使其编码的Rho蛋白具有突变：L125R。
[0007]上述突变位点为点突变，非常适合应用于基因治疗。Rho基因为RP致病突变基因，基于此制备的疾病动物模型，对于研究RP的病理生理机制及研发RP有效的治疗方法和药物都非常重要。
[0008]通过本专利技术的构建方法首次得到了基于Rho基因突变的视网膜色素变性动物模型，该疾病动物模型具有视网膜色素变性的表现或症状，为研究视网膜色素变性的病理生理机制、筛选相关基因治疗药物等提供了模型基础。
[0009]可选地，在一些实施方案中，所述目标动物为小鼠或大鼠。基于本专利技术公开的内容，在其他实施例中，本领域技术人员也可以很容易地选用其他哺乳动物构建动物模型，其也属于本专利技术的保护范围。
[0010]可选地，在一些实施方案中，利用CRISPR/Cas9技术使所述目标动物的Rho基因发生所述突变的方法包括：
[0011]将Cas9 mRNA、gRNA、以及同源重组载体显微注射到供体小鼠的受精卵中以得到转
染受精卵；其中，所述gRNA如SEQ ID NO.1所示。
[0012]采用CRISPR/Cas9技术编辑目标基因，其gRNA是基因编辑效果的重要依赖，并非任意gRNA都能实现基因编辑效果。本专利技术通过创造性劳动，选用SEQ ID NO.1作为gRNA的靶序列，能够有效地实现在靶位点的断裂，在合适Cas9 mRNA和合适同源重组载体的存在条件下，实现Rho基因的目标突变：c.374T>G，进而得到Rho蛋白具有L125R突变的动物模型，并表现出RP疾病的相应症状。
[0013]可选地，在一些实施方案中，所述Cas9 mRNA的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]可选地，在一些实施方案中，所述同源重组载体含有有SEQ ID NO.3所示的同源重组片段。所述同源重组片段包括依次串联的5
’
端同源臂、Rho基因突变序列以及3
’
端同源臂。通过引入人源化的Rho基因序列可以使得该动物模型能够更好地模拟人Rho蛋白的功能和作用。
[0015]可选地，在一些实施方案中，利用CRISPR/Cas9技术使所述目标动物的Rho基因发生所述突变的方法还包括：将所述转染受精卵卵移植到假孕母鼠的子宫中以获得F0代小鼠；再对F0代小鼠鉴定，以获得同源重组呈现阳性的嵌合体小鼠。
[0016]可选地，在一些实施方案中，利用CRISPR/Cas9技术使所述目标动物的Rho基因发生所述突变的方法还包括：将所述嵌合体小鼠与野生型小鼠交配，对获得的后代小鼠进行鉴定，将同源重组呈现阳性的F1代小鼠相互交配，对获得的F2代小鼠进行鉴定以获得杂合子小鼠或纯合子小鼠，即为视网膜色素变性动物模型。
[0017]另一方面，本专利技术提供一种视网膜色素变性动物模型的繁育方法，其包括：将由如上任一项所述的构建方法得到的视网膜变性疾病动物模型相互交配。
[0018]在通过前述构建方法得到视网膜色素变性动物模型后，本领域技术人员可以基于通过普通的繁殖或繁育方法可以得到大批量的动物模型，这对本领域技术人员而言是容易实现的，因此，采用此类繁育方法也属于本专利技术的保护范围。
[0019]另一方面，本专利技术提供由权利要求如上任一项所述的构建方法得到的视网膜色素变性动物模型在视网膜色素变性研究中的应用，所述研究是以非疾病的诊断或治疗为目的。
[0020]另一方面，本专利技术提供由如上任一项所述的构建方法得到的视网膜色素变性动物模型在筛选视网膜色素变性的基因治疗药物中的应用。
[0021]通过前述构建方法得到视网膜色素变性动物模型，具有典型的RP症状，本领域技术人员可以将其应用至各种领域的研究，例如病理生理机制研究、药物筛选研究，尤其是基因治疗类药物的筛选研究等，基于本专利技术公开的内容，这些研究对本领域技术人员而言均是容易实现的，因此，无论将本专利技术的视网膜色素变性动物模型应用于何种领域的研究，其均属于本专利技术的保护范围。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅展示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0023]图1为实施例1中的视网膜色素变性动物模型的构建策略示意图。
[0024]图2为同源重组载体质粒图谱。
[0025]图3为同源重组载体酶切鉴定电泳图；1：NheI酶切鉴定结果，理论条带大小为7475bp、3650bp、1240bp；M：1kb DNA ladder。
[0026]图4为F0及F1代小鼠鉴定策略示意图；同源重组阳性小鼠PCR鉴定方案：5
’
臂同源重组阳性基因组应扩增出4.8kb片段，阴性基因组无产物；3
’
臂同源重组阳性基因组应扩增出3.4kb片段，阴性基因组应扩增出7.0kb片段。
[0027]图5为同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定电泳图；数字45：F0代小鼠编号；WT：野生型对照；M为1kb DNA marker。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Rho基因突变的视网膜色素变性动物模型的构建方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术使目标动物的Rho基因发生突变：c.374T>G，进而使其编码的Rho蛋白具有突变：L125R。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述目标动物为小鼠或大鼠。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术使所述目标动物的Rho基因发生所述突变的方法包括：将Cas9 mRNA、gRNA、以及同源重组载体显微注射至供体小鼠的受精卵中以得到转染受精卵；其中，所述gRNA如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述Cas9mRNA的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组载体含有SEQ ID NO.3所示的同源重组片段。6.根据权利要求3
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5任一项所述的构建方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术使所述目标动物的Rho基因发生所述突...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓东，万晓玲，刘珊，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：