具有持续转基因表达的细胞制造技术

本文提供了以持续表达水平表达一种或多种转基因的基因工程化哺乳动物(例如人)细胞。还提供了制备和使用细胞的方法。还提供了制备和使用细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有持续转基因表达的细胞
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年10月9日提交的美国临时申请第62/913,062号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含已以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2020年10月9日，名为025450_WO009_SL.txt，且大小为29,071字节。
[0005]专利技术背景
[0006]细胞疗法为多种疾病和病症的治疗提供了巨大的希望。在细胞疗法中，将自体细胞或同种异体细胞移植到患者中以替换或修复有缺陷或受损的组织或细胞。可以使用多种不同类型的细胞，例如多能干细胞(PSC)、专能干细胞(例如，造血干细胞和间充质干细胞)、或分化细胞(例如，多巴胺能神经元、淋巴细胞、心肌细胞和胰岛细胞)。细胞疗法的潜在应用包括癌症、自身免疫性疾病的治疗以及在例如关节、心脏和中枢和/或外周神经系统中的受损组织的再生。
[0007]细胞疗法中的治疗性细胞可以用稳定地整合到其基因组中的转基因进行遗传修饰。转基因在表达时可以向所修饰的细胞引入新特征如通常不存在的蛋白质。然而，细胞或生物体内的稳定的长期转基因表达仍然是该领域的挑战。转基因可能受到靶细胞的预先存在的或发育调节的基因表达模式的影响。此类模式可以通过例如基因组的DNA甲基化和组蛋白修饰来覆盖来自转基因调节元件的信号，从而导致染色质重塑和转基因沉默。
[0008]将转基因整合到某些普遍表达的基因例如管家基因的基因座中也存在类似的问题。许多基因在所有人体组织中普遍地表达。由于这种表达的一致性，如果期望持续的转基因表达，来自这些基因的启动子似乎是基因工程化改造的首要候选者(Kao等人，Stem Cell Rep.(2016)9(3):518
‑
26)。然而，已经发现其中一些基因在所有已知细胞表型中并不像以前认为的那样一致地表达(de Jonge等人，PLoS One(2007)2(9):e898)。因此，使用这些管家基因的启动子进行转基因表达可能最终导致低水平的或可忽略水平的转基因表达。
[0009]因此，仍然需要鉴定在PSC和PSC衍生细胞中允许持续的转基因表达的转基因整合位点。
[0010]专利技术概述
[0011]本公开提供了经遗传修饰的哺乳动物细胞，其包含基因组中的持续转基因表达基因座(STEL)处的转基因，其中该转基因以可检测的水平表达。在一些实施方案中，转基因的表达水平(i)在五次或更多次、十次或更多次、或15次或更多次细胞传代中，或(ii)随着细胞状态改变，未改变超过40％、超过30％、超过20％、或超过10％，其中细胞状态任选地是多能性和/或分化的状态。
[0012]STEL位点可以是例如下表1中列出的基因座之一。在一些实施方案中，STEL是如表中列出的具有超过3.30、超过3.50、超过3.75、超过4.00、超过4.10、超过4.20、超过4.30、超过4.50、超过4.60、超过4.70的平均归一化表达的基因座。
[0013]在一些实施方案中，STEL是编码参与以下一项或多项的蛋白质的基因座：核糖核
蛋白复合物形成、粘着斑、细胞
‑
基底粘附连接、细胞
‑
基底连接、细胞锚定、细胞外外泌体、细胞外囊泡、细胞内细胞器、锚定连接、RNA结合、核酸结合(例如，rRNA或mRNA结合)和蛋白质结合。
[0014]在一些实施方案中，STEL是编码核糖体蛋白的基因，例如RPL基因(例如，RPL13A、RPLP0、RPL10、RPL13、RPS18、RPL3、RPLP1、RPL15、RPL41、RPL11、RPL32、RPL18A、RPL19、RPL28、RPL29、RPL9、RPL8、RPL6、RPL18、RPL7、RPL7A、RPL21、RPL37A、RPL12、RPL5、RPL34、RPL35A、RPL30、RPL24、RPL39、RPL37、RPL14、RPL27A、RPLP2、RPL23A、RPL26、RPL36、RPL35、RPL23、RPL4和RPL22)或RPS基因(例如，RPS2、RPS19、RPS14、RPS3A、RPS12、RPS3、RPS6、RPS23、RPS27A、RPS8、RPS4X、RPS7、RPS24、RPS27、RPS15A、RPS9、RPS28、RPS13、RPS、RPS5、RPS16、RPS25、RPS15、RPS20和RPS11)；编码线粒体蛋白的基因(例如，MT
‑
CO1、MT
‑
CO2、MT
‑
ND4、MT
‑
ND1和MT
‑
ND2)；编码肌动蛋白的基因(例如，ACTG1和ACTB)；编码真核翻译因子的基因(例如，EEF1A1、EEF2和EIF1)；编码组蛋白的基因(例如，H3F3A和H3F3B)；或选自FTL、FTH1、TPT1、TMSB10、GAPDH、PTMA、GNB2L1、NACA、YBX1、NPM1、FAU、UBA52、HSP90AB1、MYL6、SERF2和SRP14的基因。在特定实施方案中，STEL是GAPDH、RPL13A、RPL7或RPLP0基因座。
[0015]在一些实施方案中，转基因插入到基因座的3
’
非翻译区。在一些实施方案中，转基因序列通过自切割肽的编码序列与STEL基因序列框内连接。在一些实施方案中，转基因序列通过内部核糖体进入位点(IRES)与STEL基因序列连接。
[0016]在一些实施方案中，转基因编码治疗性蛋白、免疫调节蛋白、报告蛋白、或安全开关信号(例如自杀基因)。
[0017]在一些实施方案中，经遗传修饰的哺乳动物细胞是人细胞并且可以是例如PSC(例如胚胎干细胞或诱导的PSC)或分化细胞。在一些实施方案中，分化细胞是(i)免疫细胞，任选地选自T细胞、表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞、抑制性T细胞、髓样细胞、树突状细胞和免疫抑制性巨噬细胞；(ii)神经系统中的细胞，任选地选自多巴胺能神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、皮质神经元、脊髓或动眼神经元、肠神经元、基板衍生细胞、施万细胞和三叉神经或感觉神经元；(iii)心血管系统中的细胞，任选地选自心肌细胞、内皮细胞和结细胞；或(iv)代谢系统中的细胞，任选地选自肝细胞、胆管细胞和胰腺β细胞。
[0018]在另一方面，本公开提供了治疗有此需要的人患者的方法，其包括引入本专利技术的经遗传修饰的人细胞。还提供了用于治疗有此需要的人患者的经遗传修饰的人细胞，以及该经遗传修饰的人细胞在制备用于治疗有此需要的人的药物中的用途。
[0019]在又一方面，本公开提供了产生本文所述的经遗传修饰的哺乳动物细胞的方法，其包括提供培养的哺乳动物细胞并将感兴趣的转基因引入该培养细胞的基因组中的STEL位点。在一些实施方案中，通过CRISPR基因编辑(例如，CRISPR
‑
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.经遗传修饰的哺乳动物细胞，其包含在基因组中持续转基因表达基因座(STEL)处的转基因，其中所述转基因以可检测的水平表达，任选地其中所述哺乳动物细胞是人细胞。2.权利要求1的经遗传修饰的细胞，其中所述转基因的表达水平(i)在五次或更多次、十次或更多次或者15次或更多次传代中，或(ii)随着细胞状态改变，未改变超过40％、超过30％、超过20％或超过10％，其中所述细胞状态任选地是多能性和/或分化的状态。3.权利要求1或2的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL选自表1中列出的基因座。4.权利要求3的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL是如表1中列出的具有超过3.30、超过3.50、超过3.75、超过4.00、超过4.10、超过4.20、超过4.30、超过4.50、超过4.60、超过4.70的平均归一化表达的基因座。5.权利要求3的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL位于编码参与以下的一项或多项的蛋白质的基因处：核糖核蛋白复合物形成、粘着斑、细胞
‑
基底粘附连接、细胞
‑
基底连接、细胞锚定、细胞外外泌体、细胞外囊泡、细胞内细胞器、锚定连接、RNA结合、核酸结合(例如，rRNA或mRNA结合)和蛋白质结合。6.权利要求3的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL为编码核糖体蛋白的基因，任选地(i)RPL基因，选自RPL13A、RPLP0、RPL10、RPL13、RPS18、RPL3、RPLP1、RPL15、RPL41、RPL11、RPL32、RPL18A、RPL19、RPL28、RPL29、RPL9、RPL8、RPL6、RPL18、RPL7、RPL7A、RPL21、RPL37A、RPL12、RPL5、RPL34、RPL35A、RPL30、RPL24、RPL39、RPL37、RPL14、RPL27A、RPLP2、RPL23A、RPL26、RPL36、RPL35、RPL23、RPL4和RPL22；或(ii)RPS基因，选自RPS2、RPS19、RPS14、RPS3A、RPS12、RPS3、RPS6、RPS23、RPS27A、RPS8、RPS4X、RPS7、RPS24、RPS27、RPS15A、RPS9、RPS28、RPS13、RPS5、RPS16、RPS25、RPS15、RPS20和RPS11；编码线粒体蛋白的基因，任选地选自MT
‑
CO1、MT
‑
CO2、MT
‑
ND4、MT
‑
ND1和MT
‑
ND2；编码肌动蛋白的基因，任选地选自ACTG1和ACTB；编码真核翻译因子的基因，任选地选自EEF1A1、EEF2和EIF1；编码组蛋白的基因，例如H3F3A和H3F3B；或基因，选自FTL、FTH1、TPT1、TMSB10、GAPDH、PTMA、GNB2L1、NACA、YBX1、NPM1、FAU、UBA52、HSP90AB1、MYL6、SERF2和SRP14。7.权利要求3的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL是GAPDH基因。8.权利要求3的经遗传修饰的细胞，其中所述STEL是核糖体蛋白基因。9.权利要求8的经遗传修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：CL苏，MJ托米西玛，DC小威尔金斯，CB麦考利夫，
申请(专利权)人：蓝岩治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：