酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体A4D及其衍生突变体和应用制造技术

本发明专利技术属于饲料生物技术领域，具体涉及葡萄糖氧化酶GoxM10的酸稳定性提高的突变体A4D及其衍生突变体和应用。本发明专利技术以高热稳定性葡萄糖氧化酶GoxM10为研究材料，采用蛋白质工程改造技术对其进行酸稳定性的改良研究。最后获得酸稳定性提升的突变体，从而促进了Gox在饲料工业中的应用。料工业中的应用。料工业中的应用。

【技术实现步骤摘要】
酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体A4D及其衍生突变体和应用


[0001]本专利技术属于饲料生物
，具体涉及酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体A4D及其衍生突变体和应用。

技术介绍

[0002]葡萄糖氧化酶（Gox；EC1.1.3.4）是一种特性良好的需氧脱氢酶，在有氧条件下利用氧分子作为电子受体，催化β
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d
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葡萄糖生成d
‑
葡萄糖酸内酯和过氧化氢，随后d
‑
葡萄糖酸内酯水解成葡萄糖酸和水。近年来Gox作为一种新型抗生素替代添加剂受到饲料行业的普遍关注。Gox作为抗生素和生长促进剂的替代品，在不损害人类健康的前提下对保证动物健康和生产性能至关重要。大量应用研究表明，Gox作为一种绿色饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染和腹泻，并有促进动物生长的作用。
[0003]当前大部分动物饲料均需要经过高温制粒，所以提高Gox的热稳定性对于其在饲料中的广泛应用至关重要。此外，能够在酸性环境中维持较高的活性，以便在动物胃肠道发挥最大作用也至关重要。所以为了满足Gox在饲料工业中的应用，Gox要具备良好的热稳定性和酸稳定性。对于黑曲霉（Aspergillus niger）来源Gox稳定性改进，现有技术首先通过改善氢键相互作用、π
‑
π堆叠相互作用、疏水相互作用和酶表面电荷分布，获得了T
50
增加7.5 ℃的突变体GoxM4，随后获得比GoxM4的T
m
提高了9 ℃的突变体GoxM10。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种以来源于A. niger的高热稳定性葡萄糖氧化酶GoxM10作为母本经点突变获得的酸稳定性提高的突变体。
[0005]本专利技术的再一目的是提供编码上述突变体的基因。
[0006]本专利技术的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
[0007]本专利技术的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组菌株。
[0008]本专利技术的再一目的是提供上述突变体的应用。
[0009]本专利技术的再一目的是提供制备酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶的方法。
[0010]本专利技术的再一目的是提供一种改善葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法。
[0011]根据本专利技术的具体实施方式，对氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行定点突变。
[0012]根据本专利技术的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的葡萄糖氧化酶进行4、133、471、581、4/133、4/471、4/581等氨基酸位点的突变，从而获得葡萄糖氧化酶酸稳定性提高的突变体。
[0013]根据本专利技术的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的葡萄糖氧化酶进行A4D突变，得到氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的突变体。
[0014]根据本专利技术的具体实施方式，还提供了编码上述酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突
变体A4D的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，共1746 bp（包含终止子）。
[0015]根据本专利技术的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的葡萄糖氧化酶进行S133E突变，得到氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的突变体。
[0016]根据本专利技术的具体实施方式，还提供了编码上述酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体S133E的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。
[0017]根据本专利技术的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的葡萄糖氧化酶进行N471E突变，得到氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的突变。
[0018]根据本专利技术的具体实施方式，还提供了编码上述酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体N471E的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0019]根据本专利技术的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的葡萄糖氧化酶进行Q581E突变，得到氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
[0020]根据本专利技术的具体实施方式，还提供了编码上述酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体Q581E的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0021]根据本专利技术的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的葡萄糖氧化酶进行A4D/S133E突变，得到氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0022]根据本专利技术的具体实施方式，还提供了编码上述具有酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体A4D/S133E的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
[0023]根据本专利技术的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的葡萄糖氧化酶进行A4D/N471E突变，获得氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的突变体。
[0024]根据本专利技术的具体实施方式，还提供了编码上述酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体A4D/N471E的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
[0025]根据本专利技术的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的葡萄糖氧化酶进行A4D/Q581E突变，得到氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的突变体。
[0026]根据本专利技术的具体实施方式，还提供了编码上述酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体A4D/Q581E的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
[0027]根据本专利技术的具体实施方式，还提供了包含上述葡萄糖氧化酶突变体基因的重组载体。
[0028]根据本专利技术的具体实施例，所述重组表达载体的出发载体为pPIC9，所述重组表达载体具体为pPIC9
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goxm10
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A4D、pPIC9
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S133E、pPIC9
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N471E、pPIC9
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Q581E、pPIC9
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goxm10
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A4D/S133E、pPIC9
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goxm10
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A4D/N471E、pPIC9
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goxm10
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A4D/Q581E。
[0029]根据本专利技术的具体实施方式，还提供了包含上述葡萄糖氧化酶突变体基因的重组菌株，所述重组菌的出发菌株具体为GS115(pPIC9
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goxm10)，所述重组菌株具体为GS115(pPIC9
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goxm10
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A4D、pPIC9
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goxm10
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S133E、pPIC9
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goxm10
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N471E，pPIC9
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goxm10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体，其特征在于，具有将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D、或S133E、或Q581E、或N471E突变的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体，其特征在于，具有将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D/S133E突变的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体，其特征在于，具有将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D/Q581E突变的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体，其特征在于，具有将氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的葡萄糖氧化酶GoxM10进行A4D/N471E突变的氨基酸序列。5.一种葡萄糖氧化酶基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1
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4中任意一项所述酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体。6.包含权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂涛，黄火清，闫亚茹，张伟，姚斌，罗会颖，柏映国，王苑，苏小运，王亚茹，张杰，秦星，王晓璐，张红莲，于会民，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：