一种干细胞无血清培养基制造技术

本发明专利技术涉及一种干细胞无血清培养基。本发明专利技术特异性的提供了一种针对Rho GTP酶的单克隆抗体，所述抗体能够特异性的抑制Rho GTP酶的活性，进而调控下游ROCK1蛋白的表达，该抗体能够促进干细胞的增殖，同时还能够抑制癌细胞的侵袭和迁移能力，具有很好的应用价值。具有很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞无血清培养基


[0001]本专利技术涉及生物领域，更具体的涉及一种干细胞无血清培养基。

技术介绍

[0002]Rho GTP酶(Rho GTPase)属于Ras超家族，参与细胞迁移、吞噬、收缩和粘附等活动。ROCK又称Rho激酶(Rho
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associated kinase)，是目前功能研究最为详细的Rho下游靶效应分子。Rho/ROCK信号通路诱导细胞骨架重组、细胞迁移和应力纤维形成，与内皮通透性、组织收缩和生长等多种生理功能有关，参与糖尿病、眼疾病、肿瘤、心脏病、神经损伤性疾病、高血压、辐射损伤和白血病等疾病的发生，作为药物研发靶点越来越受到人们的关注。
[0003]Rho/ROCK信号通路通过Rho与GTP结合激活下游ROCK，并进一步磷酸化ROCK下游底物，重塑细胞骨架、诱导肌动蛋白丝稳定和肌动蛋白
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肌球蛋白收缩、组合肌动蛋白网和肌球蛋白纤维、调节微管动力。由于Rho、ROCK在体内分布广泛，因此以该通路作为靶点的药物潜成功较大。
[0004]肿瘤细胞在基质中的运动由4个循环往复的步骤组成，即头部伪足的形成和延伸，新粘附位点的建立，胞体的收缩以及尾部的退缩，通过不断重复的4个过程向前迁移。对这一过程精确调节的分子机制非常复杂，涉及胞内多条信号转导通路。在多条信号级连反应通路中，RhoGTP酶尤其是RhoA、Rac1和Cdc42是关键的调控因子，主要参与对细胞形态改变，细胞与基质粘附及细胞骨架重组的调控，调节肿瘤细胞的侵袭转移过程。细胞形态改变伪足形成和细胞形态改变是侵袭转移的起始步骤。Rac可诱导质膜突起形成片状样的层状伪足，而Cdc42诱导指头样突起的丝状伪足形成。在高侵袭和转移性的肿瘤细胞，还可见一种侵袭伪足形成，由于与细胞外基质降解密切相关，可能成为主要的伪足结构。层状伪足与周围基质形成粘附连接，产生细胞向前运动的锚着位点；丝状伪足有助于细胞对周围环境的适应及确定细胞迁移的方向。因此抑制RhoGTP酶有助有抑制肿瘤细胞。
[0005]研究者们发现基底样和三阴性乳腺癌中Rho GTP酶Rnd1是一个潜在的肿瘤转移抑制因子。敲除Rnd1蛋白破坏了上皮细胞的粘连和极性，导致上皮
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间质细胞转化的发生，同时胞内的c
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Myc表达发生紊乱、肿瘤抑制因子p53受到抑制，也导致了细胞产生肿瘤化转变。研究显示Rnd1通过激活PlexinB1蛋白的GAP结构域抑制Ras信号的传导，从而抑制Rap1的功能。而在乳腺上皮细胞中抑制Rap1会导致小鼠长出未分化但浸润性高的肿瘤。相反的，Rnd1的正常表达能够压制小鼠乳腺癌的自发性肺部转移。基因组学研究数据表明人类乳腺癌组织中RND1基因的功能受到抑制，主要机制是通过表观遗传学沉默，或极罕见的点突变造成该基因被删除。这些实验结果向我们揭示了之前未曾想见的乳腺癌发生发展机制
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Rnd1限制了Ras
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MAPK信号通路。Rho GTP酶家族的新成员能为乳腺癌治疗提供新的药物开发靶点。在其他癌中通过抑制RND1的活性，也有研究能够用于治疗癌症。
[0006]真核细胞的分裂周期是一个基础的生物学过程，它需要非常精准分子活动来保证DNA的准确度和维持细胞稳态。有研究表明ROCK蛋白在调节细胞增殖中发挥作用，在细胞增殖G1/S期以及有丝分裂过程中ROCK被活化。过表达或活化ROCKI或ROCK2可引起细胞增殖。
此外，ROCK活化可诱导catenin及其转录靶点c
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myc的表达升高，增强细胞株和小鼠表皮细胞的增殖，抑制ROCK活力会延迟胞质分裂，也会促进G1期中心粒的异常分离，从而在有丝分裂过程中出现过早的中心体迁移，表明ROCK活性在细胞周期的调节中起着重要的作用。细胞周期G1期是一个限制性节点，这一时期可以评价DNA的完整性以及确定一个细胞是否处于细胞周期循环，抑或是恢复到静止的GO期。在NIH
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3T3成纤维细胞中异位的ROCK表达可以刺激细胞s期的进程，并且增加G1/S期依赖的细胞周期蛋白(cyclin)D1的水平。相反，在角膜上皮细胞中抑制ROCK活性会削弱G1/S期的转变，这也在心肌细胞中得到了验证，抑制ROCK可以减少cyclinD3以及周期蛋白依赖的激酶(CDK)6和P27的表达。此外，在胞质分裂时ROCK蛋白活化会导致富有肌动蛋白的分裂沟的形成，同时伴随着在分裂沟下的IF的分解。抑制ROCK活性会延迟子代细胞的分裂，表明ROCK活性的精确调节对于细胞分裂的完成很重要。
[0007]目前已有研究表明在现有的干细胞扩增基础上，通过施加特异性Rho激酶抑制剂可以促进干细胞分裂过程中DNA的合成，促进干细胞的增殖和分裂，最大限度的实现干细胞的体外快速扩增，能够大量获得种子细胞。但是目前，针对Rho激酶抑制剂的种类还不够多，特别是生物活性和安全性更好的抗体类抑制剂还不够多。

技术实现思路

[0008]本专利技术一方面，以Rho GTP酶1(RND1)作为免疫原，通过小鼠，制备了Rho GTP酶单克隆抗体RND1
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23单克隆抗体。
[0009]通过本领域常规的解离常数测定方法，得到RND1
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23单抗亲和力解离常数(Kd)为5.17
×
10
－10
，属于高亲和力抗体。
[0010]RND1
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23单抗单抗的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
[0011]DLVMTQTAPSVPVTPGESVSISCRSTCLGIVIYYDYALYWFLQRPGQSPQLLIYLNSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCEFYYMQDEDFGSGTKLEIK
[0012]重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
[0013]VKPGGSLKLSCAASCGNDLRPIMSWVRQTPDKRLEWVAIGLGMREWHYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCVDMEHPYHVSKWGQGTTVTVS。
[0014]在一个实施方案中，本文提供了编码本专利技术任一实施方案的抗体的抗体重链和/或轻链可变区的分离的核酸。在一些方面，抗体的轻重链序列包含与SEQ ID NO:2和/或2至少85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列。
[0015]本专利技术制备的单克隆抗体具有较好的抑制Rho GTP酶的活性，同时也具有较好的结合特异性，针对其他蛋白如BSA、白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原等并不特异性结合。
[0016]具体的，相关方面包括单克隆抗体或其片段的变体，其包含一个或多个保守氨基酸取代，其中保留了与抗体或其片段与Rho GTP酶1表位结合相关的功能活性。相关方面还包括包含一个或多个氨基酸插入或缺失的单克隆抗体的截短或融本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性针对Rho GTP酶的单克隆抗体RND1
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23，其特征在于所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种脂肪间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基由基础培养基和添加在基础培养基中的添加成分组成，所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述添加成分为L
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谷氨酰胺、非必须氨基酸、L
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抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、乙醇胺、氢化可的松、胰蛋白酶抑制剂、人转铁蛋白、人胰岛素、bFGF、TGF
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β1、PDGF
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BB、辅酶A、丙酮酸钠和EGF以及RND1
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23单克隆抗体；其中，L
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谷氨酰胺的浓度为1
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2mM，非必须氨基酸的浓度为1
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2mM，L
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抗坏血酸的浓度为40
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60mg/L，亚硒酸钠的浓度为10
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18μg/L，纤连蛋白的浓度为15
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30mg/L，乙醇胺的浓度为1
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4mg/L，氢化可的松的浓度为7
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15mg/L，胰蛋白酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：亓爱杰，李少波，陈清轩，李斌斌，
申请(专利权)人：诺赛联合北京生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：