一种N端突变酶稳定性提升的壳聚糖酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因克隆，定点突变，基因重组技术，具体提供一种N端突变酶稳定性提升的壳聚糖酶突变体及其应用，属于酶工程领域。本发明专利技术将SaCsn46A的N端第2位脯氨酸突变为甘氨酸(P2G)，突变体在大肠杆菌Rosetta中进行表达。通过与野生型壳聚糖酶比较，发现突变酶在50℃的温度稳定性相比于野生菌型的温度稳定性提高了1.53倍。薄层色谱分析结果表明，该酶水解产物主要为氨基葡萄糖GlcN和(GlcN)2，说明突变体壳聚糖酶在温和条件下工业化生产GlcN和(GlcN)2方面具有良好的应用前景。方面具有良好的应用前景。方面具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种N端突变酶稳定性提升的壳聚糖酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因克隆，定点突变，基因重组技术，具体表述为一种N端突变酶稳定性提升的壳聚糖酶突变体及其应用，属于酶工程领域。

技术介绍

[0002]壳聚糖是由氨基葡萄糖(GlcN)通过β
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1,4
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糖苷键相连接的阳离子多糖。壳聚糖是几丁质经脱乙酰化的产物，广泛存在于低等植物真菌、藻类细胞、贝类、软体动物(如鲑鱼、鱿鱼)的外壳和软骨中，是地球上仅次于纤维素的第二大天然高分子化合物，是可再生生物资源。
[0003]壳聚糖功能优越，具有抗菌、抗肿瘤、提高免疫力等优良的生物学活性，因此，它在食品、医药、农业和化妆品等领域有广泛的应用前景。然而，有研究报道指出，壳聚糖的许多功能特性只有在被降解到一定程度时才会表现出来，它降解产物多为壳寡糖，壳寡糖不仅具有壳聚糖的所有性能，而且壳寡糖易溶于水,具有吸湿性和保湿性，能很好地应用于食品、医药、农业和化妆品业。
[0004]生产壳寡糖的方法主要有三种：物理法，化学法，酶水解法。出于产品的安全性、降解效率、环境保护的角度考虑，工业化通常采用酶解法降解壳聚糖。并且，酶水解法由于专一性强，反应条件温和，易于制备，已成为近年来的研究热点。
[0005]壳聚糖酶是专门用以降解壳聚糖为壳寡糖的一种水解酶，根据碳水化合物活性酶数据库(www.cazy.org)可知，壳聚糖酶被归类为糖苷水解酶(GH)家族46，75，80和8。GH46、GH75和GH80目前只含有壳聚糖酶，而GH8家族含有其他一些糖苷水解酶。据了解，真菌来源的壳聚糖酶主要分布在GH75家族中，而细菌来源的壳聚糖酶主要属于GH46家族，少数属于GH80。阿维菌素是一种好氧细菌，主要产阿维菌素和伊维菌素。Heggset曾报道过阿维链霉菌GH75家族的一种壳聚糖酶，主要产生长低聚物(DP ≥ 2)。然而，目前还没有关于阿维链霉菌GH46家族壳聚糖酶基因克隆和特性的报道，本研究前期利用PCR技术克隆了一种新的壳聚糖酶SaCsn46A，该酶具有广泛的底物谱，但是温度稳定性有待提高。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于，通过对壳聚糖酶进行分子改造，找到一种N端突变酶稳定性提升的壳聚糖酶突变体，使酶解法更好地应用于工业生产壳寡糖中。
[0007]本专利技术具体提供了一种N端突变酶稳定性提升的壳聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQ NO.3。本专利技术还提供了编码该壳聚糖酶突变体的基因，该基因的核苷酸序列为SEQ NO.4。
[0008]本专利技术还提供了一种重组质粒，包含了如上所述的基因。
[0009]本专利技术又提供了一种宿主细胞，包含了如上所述的基因，或包含了如上所述的重组质粒。
[0010]本专利技术提供了一种N端突变酶稳定性提升的壳聚糖酶突变体，并在大肠杆菌
Rosetta中表达。
[0011]N端突变酶稳定性提升的壳聚糖酶突变体为将壳聚糖酶SaCsn46A第2位脯氨酸突变为甘氨酸，记为P2G。
[0012]本专利技术突变体方法步骤如下：
[0013]1.设计两条引物，扩增壳聚糖酶SaCsn46A基因，去除信号肽，SaCsn46A的蛋白质序列为SEQ NO.1，基因序列为SEQ NO.2。将扩增的目的基因克隆到表达载体pET
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28a中，构建重组质粒pET
‑
SaCsn46a。
[0014]两条引物分别为：上游引物CGGGATCCGCACCCGTCGGCCTGGACGAC，下游引物CCCAAGCTTTCAGCCGATGTGGTAGCTGTC
[0015]2.利用Swiss
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Model在线软件对壳聚糖酶(SaCsn46A)进行模拟，获得壳聚糖酶的空间结构；
[0016]3.利用PoPMuSiC预测软件计算SaCsn46A每个突变氨基酸的去折叠自由能变化，确定与SaCsn46A稳定性相关的关键氨基酸位点。
[0017]4.设计定点突变引物，通过PCR技术得到突变壳聚糖酶基因，序列为SEQ NO.4，将目的基因克隆到表达载体pET
‑
28a，获得含有突变壳聚糖酶基因序列的重组载体pET
‑
P2G；
[0018]两条引物分别为：上游引物CGGGATCCGCAGGCGTCGGCCTGGACGAC和下游引物CCCAAGCTTTCAGCCGATGTGGTAGCTGTC。
[0019]酶切位点为BamHⅠ和HindⅢ。
[0020]5.将步骤4的重组载体转入大肠杆菌进行诱导培养，离心后收集菌体，经超声破碎细胞后，使用Ni
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NTA亲和层析柱进行蛋白纯化获得突变壳聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ NO.3。
[0021]本专利技术使用的壳聚糖酶SaCsnA具有较广的底物谱，提供的突变体温度稳定性显著提升，且在提高温度稳定性的同时并没有对该酶的其他特性造成影响。在适宜条件下突变酶仍能将壳聚糖水解为GlcN和(GlcN)2，说明本专利技术所述的突变壳聚糖酶在工业化生产中具有良好的应用前景。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例中的野生型壳聚糖酶及壳聚糖酶突变体的温度稳定性。
具体实施方式
[0023]本专利技术不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本专利技术公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本专利技术的，或者凡是采用本专利技术的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本专利技术的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0024]本专利技术下面结合实施例作进一步详述：
[0025]1.壳聚糖酶突变位点的确认
[0026]利用Swiss
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Model以链霉菌N174(Streptomyces sp.N174)壳聚糖酶(1CHK_A)为模板对SaCsn46A进行蛋白三维结构模拟，获得壳聚糖酶的空间结构，利用PoPMuSiC预测软件计算SaCsn46A每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(ΔΔG)，来辅助设计提高其稳定性，确
定与SaCsn46A稳定性相关的关键氨基酸位点，由于壳聚糖酶第2位氨基酸的去折叠自由能变化相对较大，因此通过设计引物进行PCR获得相应的突变质粒。
[0027]SaCsn46A的蛋白序列如SEQ NO.1所示。
[0028]两条引物分别为：上游引物CGGGATCCGCAGGCGTCGGCCTGGACGAC和下游引物CCCAAGCTTTCAGCCGATGTGGTAGCTGTC。
[0029]PCR体系：
[0030][0031][0032]模板为pET
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SaCsn46a。
[0033]PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，64℃退火1min，68℃延伸10min，15个循环，4℃保温。
[0034]2.DpnI消化模板质粒
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种N端突变酶稳定性提升的壳聚糖酶突变体，其特征在于：蛋白序列为SEQ NO.3。2.一种基因，其特征在于：所述基因编码权利要求1所述的壳聚糖酶突变体，该基因的核苷酸序列为SEQ NO.43.一种重组质粒，其特征在于：包含了权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭静，高文君，赵晗，满在伟，蔡志强，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：