特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA及其体外合成引物和抗病性的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA及其体外合成引物和抗病性应用，属于烟草黄瓜花叶病毒防治技术领域。本发明专利技术利用RNA沉默的原理，利用PVY病毒自身CP基因提供了一种能够特异性抗PVY病毒的dsRNA，以及这种dsRNA的体外合成方法和在烟草PVY病毒防治时的应用方法；为烟草烟草马铃薯Y病毒防治提供新思路，避免了化学用药的诸多弊端；该方法简单有效，不存在转基因安全风险，更容易进行大田推广应用；后期可以结合细胞工厂化生产dsRNA，可为烟草病毒病防治提供一种简单、有效和廉价的新方法，也可为其它植物病毒病防治提供借鉴。供借鉴。供借鉴。

DsRNA with specific resistance to tobacco PVY virus and its in vitro synthetic primers and application to disease resistance

【技术实现步骤摘要】
特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA及其体外合成引物和抗病性的应用


[0001]本专利技术属于烟草黄瓜花叶病毒防治
，特别是特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA及其体外合成引物和抗病性应用。

技术介绍

[0002]烟草马铃薯Y病毒(Potato virus Y，以下简称PVY病毒)是我国烟草上的重要病害，每年造成的损失位列十大烟草侵染性病害名单前列。PVY病毒主要危害烟草、辣椒，番茄等茄科植物，属于系统性侵染病害。PVY侵染烟草时，会导致烟草的叶脉坏死、褐脉、黄斑，影响了烟叶的质量和产量。我国受PVY威胁烤烟面积年均300万亩(约20万公顷)。目前，烟草在种植、生产时，主要采取治虫防病、药剂防治等措施防治，防治效果不高。局部地区PVY暴发的情况仍然时有发生，PVY的防控仍然是烟叶生产中的一个热点和难点。
[0003]PVY病毒基因组编码一个大的多聚蛋白，长为360kD，进行翻译表达的过程中，包括经病毒自身编码的NIa、HC
‑
Pro、PI三种蛋白酶的第一蛋白(first protein，PI)，木瓜蛋白酶相似的辅助蛋白(Helper component proteinase，HC
‑
Pro)，与32kD大小的豌豆花叶病毒蛋白相似的第三蛋白(third protein，P3)，含有两个疏水氨基酸序列的6kD蛋白6K1和6K2，与解旋酶相似的圆柱形内含体蛋白(cylindrical protein，CI)，具有丝氨酸蛋白酶特性的核内含体蛋白a(Nuclear Inclusion body
‘
a
’
protein，NIa)，具有核定位信号的核内含体蛋白b(Nuclear Inclusion body
‘
b
’
protein，NIb)和外壳蛋白CP。黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)的基因组分别在3条正义单链的RNA分子中，编码5个蛋白，即复制酶1a、2a、2b蛋白和移动蛋白(movement protein，MP)、外壳蛋白(coat protein，CP)。其中外壳蛋白CP是PVY唯一的结合蛋白，参与到病毒传播和增殖进程，是PVY病毒病生物防治的一个理想靶基因。
[0004]近年来，RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)在作物抗病虫害领域逐渐崭露头角。它是指在转录后通过RNA调控基因表达，在真核细胞中引入双链RNA(即dsRNA)分子从而导致具有序列同源性的基因产生的特异性基因沉默(gene silencing)现象。当真核细胞内出现dsRNA时，胞质中的核酸内切酶Dicer便将其切割成长度为21
‑
23bp的小片段RNA(即siRNA)。在RNA解旋酶的作用下，siRNA双链被解开形成正义链和反义链。此刻出现的反义链随后与内切酶、外切酶及解旋酶等结合形成具有核酸酶功能的RNA诱导的沉默复合物(RNA
‑
induced silencing complex，RISC)。RISC与mRNA中的同源区特异性结合并在与siRNA反义链互补结合的两端切割mRNA，mRNA一旦被这样切割便立即被降解。通过这种方式，dsRNA引发了细胞对其同源靶基因RNA的降解反应。目前，已有研究通过体外合成P126(TMV RNA沉默抑制)和外壳蛋白(CP)基因的dsRNA，与烟草花叶病毒(TMV)混合接种烟草后，烟株获得了TMV抗性，外源的dsRNA同样诱导了烟株本身的系统性RNAi，在未接种的其他叶片组织中也检测到了RNAi效应。澳大利亚学者通过将CMV病毒2b基因的dsRNA分子与黏土纳米颗粒LDH紧密结合，能够让dsRNA长时间停留在植物叶面，从而将RNAi沉默基因的作用时间可以延长
到20天以上，大幅降低了利用dsRNA进行病虫害防治的成本(文献“Exogenous application of double
‑
stranded RNA molecules from TMV p126 and CP genes confers resistance against TMV in tobacco[J]”.Konakalla NC,Kaldis A,Berbati M,et al.Planta,2016,244(4):961
‑
969；文献“Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses[J]”.Mitter N,Worrall EA,Robinson KE,et al..Nature Plants,2017,3:16207.)。因此，基于dsRNA的基因沉默技术在烟草PVY病毒绿色防控领域具有非常光明的应用前景及切实可行的操作性。

技术实现思路

[0005]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供一种PVY病毒的dsRNA，并将其针对烟草植物体外施用后，有效提高了烟草中PVY抗性，形成一种烟草PVY病毒病防治的新方法，具体通过以下技术实现。
[0006]一种特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术还提供了一种体外合成上述特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA的引物对，
[0008]正向引物PCP
‑
F的核苷酸序列为：5
’‑
GCAAATGACACAATCGATGC
‑3’
，
[0009]反向引物PCP
‑
P的核苷酸序列为：5
’‑
TTGCCTAAGGGTTGGTTTTG
‑3’
。
[0010]优选地，在上述正向引物和反向引物的5
’
端还均添加了T7启动子序列；
[0011]添加了T7启动子序列的正向引物PCP
‑
T7F的核苷酸序列为：5
’‑
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCAAATGACACAATCGATGC
‑3’
；
[0012]添加了T7启动子序列的反向引物PCP
‑
T7P的核苷酸序列为：5
’‑
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTTGCCTAAGGGTTGGTTTTG
‑3’
。
[0013]本专利技术还提供了一种上述特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA的体外合成方法，包括以下步骤：
[0014]S1、从感染PVY病毒的烟株叶片中提取烟草PVY病毒的总RNA，以总RNA为模板，反转录获得病毒样本的cDNA；
[0015]可以采用常规的植物RNA快速提取试剂盒，按照试剂盒相应的说明书进行提取步骤；例如GenePure多糖多酚植物RNA快速提取试剂盒；
[0016]可以利用琼脂糖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种体外合成权利要求1所述的特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA的引物对，其特征在于，正向引物PCP
‑
F的核苷酸序列为：5
’‑
GCAAATGACACAATCGATGC
‑3’
，反向引物PCP
‑
P的核苷酸序列为：5
’‑
TTGCCTAAGGGTTGGTTTTG
‑3’
。3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，在所述正向引物和反向引物的5
’
端还均添加了T7启动子序列；添加了T7启动子序列的正向引物PCP
‑
T7F的核苷酸序列为：5
’‑
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCAAATGACACAATCGATGC
‑3’
；添加了T7启动子序列的反向引物PCP
‑
T7P的核苷酸序列为：5
’‑
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTTGCCTAAGGGTTGGTTTTG
‑3’
。4.权利要求1所述的特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA的体外合成方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、从感染PVY病毒的烟株叶片中提取烟草PVY病毒的总RNA，以总RNA为模板，反转录获得病毒样本的cDNA；S2、以步骤S1所得cDNA为模板进行PCR扩增，纯化回收目的片段；S3、将纯化回收的目的片段连接至载体上，再将载体加入感受态细胞中，培养扩增，挑取阳性克隆的CP蛋白，对C...

【专利技术属性】
技术研发人员：许汝冰，李锡宏，黎妍妍，
申请(专利权)人：湖北省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：