【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进甲基化多核苷酸结合的方法、组合物和系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年11月26日提交的美国临时专利申请第62/940,853号的优先权的权益，为了所有目的将该美国临时专利申请通过引用并入本文。
[0003]背景
[0004]癌症是全世界疾病的主要原因。每年，在世界各地，数千万人被诊断为患有癌症，并且多于一半的患者最终因其而死亡。在许多国家，癌症列为继心血管疾病之后第二大最常见的死亡原因。早期检测与许多癌症的改善结果相关。
[0005]癌症可以由个体的正常细胞内的遗传变异的积累引起，这些遗传变异中的至少一些导致不当调控的细胞分裂。这样的变异通常包括拷贝数变异(CNV)、单核苷酸变异(SNV)、基因融合、插入和/或缺失(indel)，表观遗传变异包括胞嘧啶的5
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甲基化(5
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甲基胞嘧啶)以及DNA与染色质和转录因子的缔合。
[0006]癌症通常通过对肿瘤进行活检，然后分析细胞、标志物或从细胞中提取的DNA来检测。但最近已提出癌症也可以从体液诸如血液或尿液中的无细胞核酸来检测。这样的测试具有的优点在于它们是非侵入性的，并且可以在无需在活检中鉴定疑似癌细胞的情况下进行。然而，由于体液中核酸的量非常低而且核酸存在的形式是异质性(例如，RNA和DNA，单链和双链，以及复制后修饰的各种状态和与蛋白诸如组蛋白的缔合)的事实，这样的液体活检测试是复杂的。
[0007]概述
[0008]在一方面，本公开内容提供了检测受试者中存在或不存在肿...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测受试者中存在或不存在肿瘤的方法，所述方法包括：(i)从所述受试者获得多核苷酸样品；(ii)向所述多核苷酸样品添加载体核酸分子的集合以生成第一样品；其中所述载体核酸分子的集合包括：(a)至少一个未甲基化载体核酸分子子集；和/或(b)至少一个甲基化载体核酸分子子集其中所述载体核酸分子的至少一个末端被修饰以防止连接，其中所述未甲基化载体核酸分子不包含甲基化核苷酸，并且所述甲基化载体核酸分子包含一个或更多个甲基化核苷酸；(iii)使用与甲基化多核苷酸选择性结合的捕获剂将所述第一样品分区成至少两个分区的集合，从而生成分区的样品；(iv)处理所述分区的样品的至少一部分以生成处理的样品，其中所述处理包括以下中的至少一种：(a)加标签、(b)扩增和(c)针对感兴趣的特定区域富集分子；(v)对所述处理的样品的至少一部分进行测序以生成测序读段的集合；以及(vi)分析所述测序读段的集合的至少一部分以检测存在或不存在肿瘤。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体核酸分子的长度在25bp和325bp之间。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的第一子集和第二子集包含相同的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的第一子集和第二子集包含不同的核苷酸序列。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集和所述第二子集在核苷酸序列中包含一个或更多个CpG二核苷酸。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集中的一个或更多个CpG二核苷酸的位置不同于所述第二子集中的一个或更多个CpG二核苷酸的位置。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集中的CpG二核苷酸的数目不同于所述第二子集中的CpG二核苷酸的数目。8.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集中与一个或更多个CpG二核苷酸相邻的核苷酸的序列不同于所述第二子集中与一个或更多个CpG二核苷酸相邻的核苷酸的序列。9.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的第一子集和第二子集具有不同的长度。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或更多个甲基化核苷酸选自由以下组成的组：(i)5
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甲基胞嘧啶，(ii)6
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甲基腺嘌呤，(iii)羟甲基胞嘧啶，(iv)甲基尿嘧啶，和(v)任何其他甲基化核苷酸。11.根据权利要求10所述的方法，其中甲基化核苷酸的数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、17、18、19或至少20。12.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的第一子集和第二子集包含相同的核苷酸序列。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的第一子集和第二子集包含不同的核苷酸序列。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集和所述第二子集在核苷酸序列中包含一个或更多个CpG二核苷酸。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一个或更多个CpG二核苷酸包含一个或更多个甲基化胞嘧啶。16.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集中的一个或更多个甲基化核苷酸的位置不同于所述第二子集中的一个或更多个甲基化核苷酸的位置。17.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集中的甲基化核苷酸的数目不同于所述第二子集中的甲基化核苷酸的数目。18.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集中与一个或更多个甲基化核苷酸相邻的核苷酸的序列不同于所述第二子集中与一个或更多个甲基化核苷酸相邻的核苷酸的序列。19.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的第一子集和第二子集具有不同的长度。20.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集与所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的量的比为约0:1、0.1:99.9、0.5:99.5、0.75:99.25、1:99、1:95、1:90、1:80、1:75、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:25、1:20、1:10、1:5、1:2、1:1.15、1:1、1.15:1、2:1、5:1、10:1、20:1、25:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、75:1、80:1、90:1、95:1、99:1、99.25:0.75、99.5:0.5、99.9:0.1或1:0。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸样品与所述载体核酸分子的集合的量的比为约1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:4、1:0.5、1:6、1:7、1:8、1:0.9、1:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:200、1:300；1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:5000、1:10,000、1:100,000、1:500,000、1:106、1:107、1:108或1:109。22.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸样品为最多1μg。23.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸样品为最多200ng。24.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸样品为最多150ng。25.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸样品为最多100ng。26.根据权利要求22
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25中任一项所述的方法，其中所述载体核酸分子的集合以足够的量添加，使得所述多核苷酸样品和所述载体核酸分子的集合的总量为约175ng、200ng、225ng、250ng、275ng、300ng、350ng、400ng、450ng、500ng、600ng、700ng、750ng、800ng、900ng、1μg、1.1μg、1.25μg或1.5μg。27.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体核酸分子的序列选自由以下组成的组：(i)来自病毒基因组的序列，(ii)来自细菌基因组的序列，(iii)来自λ基因组的序列，和(iv)来自非人类基因组的序列。28.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体核酸分子是合成的DNA。29.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体核酸分子的至少一个末端包含C3(丙基
基团)间隔物。30.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体核酸分子的至少一个末端包含双脱氧核苷酸。31.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体核酸分子的至少一个末端包含防止羟基基团用作亲核体的任何化学修饰。32.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体核酸分子包含尿嘧啶核苷。33.根据权利要求32所述的方法，所述方法还包括在扩增前添加尿嘧啶去糖基化酶和DNA糖基化酶
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裂解酶。34.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体核酸分子的5
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末端包含以下修饰中的至少一种：(i)反向(5
’‑5’
)诸如双脱氧胸腺嘧啶、双脱氧胞嘧啶、双脱氧鸟嘌呤或双脱氧腺嘌呤；(ii)丙基基团，或(iii)其他有机官能团，例如但不限于苄基、乙基或甲基。35.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体核酸分子的3
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末端包含以下修饰中的至少一种：(i)任何双脱氧碱基诸如双脱氧胸腺嘧啶、双脱氧胞嘧啶、双脱氧鸟嘌呤或双脱氧腺嘌呤，其可以酶促添加或在合成过程中添加；(ii)丙基基团，或(iii)其他有机官能团，例如但不限于苄基、乙基或甲基。36.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸样品从组织、血液、血浆、血清、尿液、唾液、粪便、脑脊液、颊拭子或胸膜穿刺获得。37.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸样品从组织获得。38.根据权利要求37所述的方法，其中从所述组织获得的所述多核苷酸样品通过酶促或机械手段来片段化。39.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸样品从血液获得。40.根据权利要求39所述的方法，其中来自所述血液的所述多核苷酸样品是无细胞DNA样品。41.一种载体核酸分子的集合，所述载体核酸分子的集合包括：(i)至少一个未甲基化载体核酸分子子集；和/或(ii)至少一个甲基化载体核酸分子子集，其中所述载体核酸分子的至少一个末端被修饰以防止连接，其中所述未甲基化载体核酸分子不包含甲基化核苷酸，并且所述甲基化载体核酸分子包含一个或更多个甲基化核苷酸。42.根据权利要求41所述的载体核酸分子的集合，其中所述载体核酸分子的长度在25bp和325bp之间。43.根据权利要求41所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的第一子集和第二子集包含相同的核苷酸序列。44.根据权利要求41所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的第一子集和第二子集包含不同的核苷酸序列。45.根据权利要求43或44所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集和所述第二子集在核苷酸序列中包含一个或更多个CpG二核苷酸。46.根据权利要求45所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个未甲基化载体核
酸分子子集的所述第一子集中的一个或更多个CpG二核苷酸的位置不同于所述第二子集中的一个或更多个CpG二核苷酸的位置。47.根据权利要求45所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集中的CpG二核苷酸的数目不同于所述第二子集中的CpG二核苷酸的数目。48.根据权利要求45所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集中与一个或更多个CpG二核苷酸相邻的核苷酸的序列不同于所述第二子集中与一个或更多个CpG二核苷酸相邻的核苷酸的序列。49.根据权利要求41所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个未甲基化载体核酸分子子集的第一子集和第二子集具有不同的长度。50.根据权利要求41所述的载体核酸分子的集合，其中所述一个或更多个甲基化核苷酸选自由以下组成的组：(i)5
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甲基胞嘧啶，(ii)6
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甲基腺嘌呤，(iii)羟甲基胞嘧啶，(iv)甲基尿嘧啶，和(v)任何其他甲基化核苷酸。51.根据权利要求50所述的载体核酸分子的集合，其中甲基化核苷酸的数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、17、18、19或至少20。52.根据权利要求50所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的第一子集和第二子集包含相同的核苷酸序列。53.根据权利要求50所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的第一子集和第二子集包含不同的核苷酸序列。54.根据权利要求52或53所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集和所述第二子集在核苷酸序列中包含一个或更多个CpG二核苷酸。55.根据权利要求54所述的载体核酸分子的集合，其中所述一个或更多个CpG二核苷酸包含一个或更多个甲基化胞嘧啶。56.根据权利要求52或53所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集中的一个或更多个甲基化核苷酸的位置不同于所述第二子集中的一个或更多个甲基化核苷酸的位置。57.根据权利要求52或53所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的所述第一子集中的甲基化核苷酸的数目不同于所述第二子集中的甲基化核苷酸的数目。58.根据权利要求53所述的载体核酸分子的集合，其中所述至少一个甲基化载体核酸分子子集的所...
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