肿瘤靶向多肽的筛选和应用制造技术

本发明专利技术提供一种胰腺癌靶向多肽的序列及优化的筛选方法和所得多肽的应用。筛选所得到的多肽具有良好的胰腺癌细胞和组织的靶向性，在应用于研发胰腺癌及其他肿瘤的早期诊断试剂，手术引导剂及主动靶向治疗相关药物等方向具有潜在价值。具有潜在价值。

【技术实现步骤摘要】
肿瘤靶向多肽的筛选和应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学及生物医药
，特别涉及一种与肿瘤细胞和组织特异性结合的多肽，这些肿瘤的特征为高表达膜联蛋白A2蛋白。本专利技术还涉及这类多肽的优化筛选方法及应用。

技术介绍

[0002]主动靶向给药系统中，各种类型的靶向部分，如抗体，多肽，适体等分已被用于活性药物靶向性。其中，多肽由于与生物体内执行功能的蛋白质具有相同的构件，所以在生物研究和应用中常作为蛋白质的替代物。与其他靶向部分相比，肽是很有前途的靶向配体。再加上多肽分子量小、稳定性高、合成方便，并且多肽易被化学改性调整其亲和力、电荷、亲疏水性、稳定性和溶解性，可通过反复的优化修改在体内使用，肽配体已被探索作为靶向配体广泛的药物输送系统。目前已报道了多种多肽荧光探针，这些探针可用于检测各种物质，包括金属离子、蛋白质、氧化还原指标、肿瘤微环境等。此外，多肽在药物载体设计方面也受到了越来越多的关注。例如，利用多肽构建响应型（包括还原响应、PH响应以及酶响应等）纳米载药体系能够控制药物的释放速率，使药物稳定发挥作用，并且降低药物对正常细胞的毒副作用。在这一体系中，多肽作为配体被引入，主要承相响应性功能。因此，合理设计并筛选出对肿瘤靶向多肽，逐渐成为抗肿瘤新药、诊断探针及靶向递送研究的重要方向。
[0003]噬菌体展示技术（Phage Display Technology）是筛选特异性结合多肽的一种有效方法。其原理是将特定的外源基因片段插入到编码噬菌体蛋白外壳的基因阅读框中，在不影响蛋白外壳编码基因自身正常表达的前提下，使植入的外源基因随着编码外壳蛋白的基因共同表达出来，这样，外源基因编码的多肽能够以融合蛋白的形式出现在噬菌体的蛋白外壳表面。由于蛋白质相互作用的独立性和特异性，被展示的外源多肽能够较为完整地保持独立的空间结构和生物学功能。噬菌体展示技术具有简便、高效、大通量筛选等优点，在细胞生物学和蛋白质工程方面已得到普遍应用，被广泛用于抗肿瘤药物、肿瘤诊断标志物等的筛选和研发，尤其在单克隆抗体制备、蛋白质特异性结合研究、肿瘤抗原筛选及识别等领域均取得诸多进展。如今，噬菌体展示技术已成为发现新功能多肽和改变已有多肽性质的强有力工具，许多特异性结合肽通过靶向肿瘤相关蛋白或肿瘤细胞和普通组织细胞的减性筛选，已用于肿瘤早期筛查和检测。
[0004]膜联蛋白A2为脊椎动物膜联蛋白家族中的一员。在肿瘤细胞常表现异常高表达，提示与肿瘤细胞的粘附、增殖、侵袭和迁移等生理活动发生、转移、病例分级和预后息息相关。在胰腺癌肿瘤发生时，尤其异常高表达显著，提示膜联蛋A2可以作为靶向胰腺癌的诊疗的新靶标。“癌中之王”之称的胰腺癌中膜联蛋白A2的异常高表达与胰腺癌的侵袭性和耐药性息息相关，造成胰腺癌高死亡率的一个重要原因是缺乏早期检测方法和胰腺癌细胞的高度耐药性。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种对胰腺癌细胞和组织特异性结合的多肽，通过并用靶向筛选法和细胞减性筛选法，产生对胰腺癌细胞选择性的亲和力，以用于胰腺癌的早期精准诊断和靶向治疗。
[0007]本专利技术采用以下技术方案实现专利技术目的：第一方面，本专利技术提供了一种胰腺癌靶向多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.4之一所示的氨基酸序列。
[0008]表1 氨基酸序列表上述多肽中单字母符号代表的氨基酸的缩写形式，氨基酸缩略表见表2。
[0009]表2 氨基酸缩略表
第二方面，本专利技术提供了一种DNA片段，所述DNA片段包含编码本专利技术所述如 SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.4 之一所示的多肽的氨基酸序列。
[0010]第三方面，本专利技术还供了一种表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的编码氨基酸序列为 SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.4 所示肽的本专利技术第二方面所述的DNA片段。
[0011]第四方面，本专利技术提供了一种原核或真核宿主细胞，该宿主细胞含有如本专利技术第三方面所述的表达载体。
[0012]第五方面，本专利技术提供了一种二价体或多价体，由本专利技术第一方面 SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.4 的所述肽组装而成；所述的二价体或多价体具有胰腺癌或其他肿瘤细胞组织特异性靶向作用；作为优选技术方案，所述的二价体或多价体是通过与连接分子和/或聚合物共价连接形成或通过与连接分子和/或聚合物混合、非共价连接形成的。
[0013]第六方面，本专利技术还进一步提供了一种偶联物，包含本专利技术第一方面如 SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.4 之一所述的多肽或第五方面所述多肽的二价体或多价体作为靶向多肽及能杀伤癌细胞的制剂。
[0014]包括一种药物组合，其包含所述的多肽与药物活性成分，作为用于肿瘤治疗的药物。
[0015]也可作为修饰到载有药物的载体如纳米材料、脂质体。
[0016]一种多肽分子探针，包含本专利技术第一方面和第五方面所述的所述多肽其多价体。
[0017]一种显像剂，包含本专利技术第一方面和第五方面所述的所述多肽其多价体，加上显影剂或放射性核素，用于临床肿瘤的成像和诊断。
[0018]第七方面，本专利技术提供了一种筛选肿瘤细胞靶向识别多肽的筛选方法，包括以下步骤：以人源性胰腺癌导管上皮细胞PANC
‑
1作为靶细胞，人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6
‑
C7为吸附细胞对噬菌体展示文库进行减性筛选，两轮筛选后，将纯化后的ANXA2重组蛋白固定于96孔板上进行第三、四轮筛选再将与膜联蛋白A2结合的阳性噬菌体洗脱、测序翻译成氨基酸序列。
[0019]本专利技术所述多肽来源于噬菌体展示十二肽文库，文库容量为1
×
10
11
。
[0020]第八方面，本专利技术还提供了本专利技术第一方面如 SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.4 所述的多肽或所述多肽形成的二价体或多价体在制备用于免疫治疗、预防或诊断癌症的药物或显像制剂中的用途；所述癌症优选为胰腺癌、肝癌、卵巢癌、大肠癌，脑胶质瘤，胃癌，乳腺癌，肺癌。
[0021]本专利技术利用了噬菌体展示技术，优化了筛选肿瘤靶向多肽的方法，所得到的多肽对癌细胞特异性亲和力强，为进一步研发肿瘤的诊断试剂及靶向治疗药物奠定了基础。
[0022]本专利技术具有以下有益效果：（1）本专利技术所述的多肽能够特异性结合胰腺导管癌细胞和组织，而不识别正常胰腺上皮细胞和组织，属于胰腺癌特异性靶向多肽，其本身及衍生物可成为胰腺癌更精准的诊断和靶向治疗的候选药物。
[0023]（2）多肽类药物在生产上应用生物工程技术，规模化低成本生产和纯化相对容易实现，兼有相对分子质量小、免疫原性弱、生物活性高等优点，多肽类用于更广泛的应用前景。
[0024]（3）本专利技术中所应用的组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胰腺癌靶向多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：DENGLRIMTLQSVLW(SEQ ID NO.1)，NGVTDYWRGVYNKDH(SEQ ID NO.2)，NLRGIPAKKSDVMQD(SEQ ID NO.3)，ATSHLHVRLPSKEVN(SEQ ID NO.4)的任一序列或...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏丽杰，马赫遥，姜凯，雷雨，洪宇涵，
申请(专利权)人：辽宁中健医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：