一种利用滚环扩增合成纳米酶的方法、纳米酶及其应用技术

本发明专利技术属于生物医药领域，公开了一种合成人工纳米酶的方法，该方法通过滚环扩增(RCA)构建具有周期性重复多聚腺嘌呤(polyA)茎环单元的单链DNA框架，以该DNA框架为模板，在其茎环单元上生长金纳米颗粒，通过调节框架的序列长度及polyA单元间隔序列的长度、以及金前驱体的浓度等，可以调控金纳米颗粒的数量及空间间隔，以此构建催化活性可编程的纳米酶。本发明专利技术方法合成的纳米酶具有可编程的过氧化物酶催化活性，具有广泛应用前景。具有广泛应用前景。具有广泛应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用滚环扩增合成纳米酶的方法、纳米酶及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种一种利用滚环扩增合成纳米酶的方法、纳米酶及其应用，具体涉及一种通过对滚环扩增(RCA)模板序列及扩增时间设计，调控编码纳米酶中金纳米颗粒的数量及空间间隔，实现调控纳米酶具有类过氧化氢酶催化活性的合成方法。

技术介绍

[0002]由于易于制造、高稳定性及低成本等特点，具有催化活性的金属纳米颗粒已经被开发作为自然酶的仿生物—纳米酶。比如，金纳米颗粒具有葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的催化活性，已经被广泛用于生物传感中信号产生、基于活性氧的杀菌与癌症治疗及纳米机器人中的动力源。金纳米颗粒的催化活性高度依赖其暴露的催化表面，因此，相对于大尺寸纳米颗粒，多个小尺寸纳米颗粒组装形成团簇，具有更大的比表面积，更适合纳米酶的开发。近年来，通过自下而上的自组装构建高度有序的金属纳米颗粒团簇的研究取得了很大进展，然而该方法需要用DNA或蛋白等对金属纳米颗粒表面进行高密度修饰，这将覆盖其催化表面，抑制纳米酶的催化活性。现有技术还报道了是利用预先制备的模板进行金属纳米颗粒的原位生长和沉积，这种方法虽然能够保护金属纳米颗粒的催化表面，但无法调控纳米颗粒间的空间间隔，同样影响纳米酶的催化活性。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是为了解决现有纳米酶合成中纳米颗粒的数量及空间间隔无法调控的问题，提供一种利用滚环扩增DNA编码纳米颗粒的数量及空间间隔，以实现催化活性可编程的纳米酶合成方法。
[0004]本专利技术的目的之一是提供一种纳米酶，所述纳米酶包括具有周期性重复多聚腺嘌呤茎环单元的单链DNA框架，以及在所述单链DNA框架的茎环单元上生长的金纳米颗粒。
[0005]本专利技术的另一目的是提供如上所述的纳米酶的合成方法，所述方法以具有周期性重复多聚腺嘌呤茎环单元的单链DNA框架为模板，以该单链DNA框架的茎环单元为生长位点，在其上生长金纳米颗粒，得到所述纳米酶。
[0006]本专利技术的另一目的是提供如上所述方法制备得到的纳米酶。
[0007]本专利技术的另一目的是提供如上纳米酶在作为过氧化物酶中的应用。
[0008]本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术通过对RCA模板的序列设计，调控纳米酶中金属纳米颗粒的数量和空间间隔，实现对纳米酶催化活性的可编程调控。同时，相对于传统的基于DNA修饰金纳米颗粒构建纳米酶的技术，本专利技术构建的纳米酶最大程度的暴露了金纳米颗粒的催化表面，表现出更高的过氧化氢酶催化活性。
附图说明
[0009]图1为本专利技术制备纳米酶方法的示意图。
[0010]图2为本专利技术实施例1中经RCA扩增合成的单链DNA框架的(a)凝胶电泳成像图、(b)AFM成像图及(c)激光共聚焦荧光成像图。
[0011]图3为本专利技术实施例1中(a)经RCA扩增合成的单链DNA框架的AFM成像图及(b)高度统计，(c)合成的纳米酶AFM成像图及(d)高度统计，(e)不同尺寸单链DNA框架与纳米酶的占比对比，(f)单链DNA框架与纳米酶的高度对比，(g)纳米酶的TEM成像图及(h)元素分布分析和(I)纳米酶的EDX分析结果。
[0012]图4为本专利技术实施例1中合成的(a)纳米酶的TEM成像图(与图3g相同，仅观察视野不同)、(b)吸收光谱及(c)暗场显微成像图。
[0013]图5为本专利技术实施例1中合成的单链DNA框架及纳米酶的TMB显色图及化学反应方程式。
[0014]图6为本专利技术实施例1中合成的纳米酶催化活性最适pH(a)和最适温度(b)。
[0015]图7为本专利技术实施例2中不同合成活性最佳纳米酶的金前驱体浓度得到的纳米酶的紫外光吸收谱(a，下图)，TMB显色图(b，上图)以及在652nm处最大吸收峰值散点图(b，下图)。
[0016]图8为本专利技术实施例3中调控RCA的时间，合成的三种不同序列长度的单链DNA框架(Scaffold
n
‑
1到3)的AFM图(a)、尺寸分布统计图(c)，三种不同纳米酶(GNC
n
‑
1到3)的TEM成像图(b)、尺寸分布统计图(d)、及米氏方程拟合曲线(e)。
[0017]图9为本专利技术实施例3中合成的三种纳米酶(GNC
n
‑
1到3)的催化TMB显色反应的时间动力学光谱吸收曲线。
[0018]图10为本专利技术合成的三种单链DNA框架1
‑
3(Scaffold
n
‑
1到3)的AFM成像图(依次为a～c)及纳米酶1
‑
3(GNC
n
‑
1到3)的TEM成像图(依次为d～f)。
[0019]图11为本专利技术调控生长单元间隔序列长度合成两种纳米酶(GNC
n
‑
3和GNC
n
‑
4)的结构示意图和TEM成像图(a)及粒径分布统计图(b)、吸收光谱(c)、TMB光吸收值随时间改变图(d)、米氏方程拟合曲线(e)及GNC
n
‑
3与游离金纳米颗粒(Free GNPs)和辣根过氧化物酶(HRP)米氏常数的统计图(f)。
[0020]图12为本专利技术实施例4中合成的纳米酶
‑
3和纳米酶
‑
4的TEM成像图；其中a图为GNC
n
‑
3的TEM图，b图为GNC
n
‑
4的TEM图(相对于图11a，观察视野更大)。
[0021]图13为SEQ ID NO.1所示的单链DNA模板形成的茎环结构示意图。
[0022]图14为SEQ ID NO.2所示的单链DNA模板形成的茎环结构示意图。
[0023]图15为SEQ ID NO.3所示的单链DNA模板形成的茎环结构示意图。
具体实施方式
[0024]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。
[0025]本专利技术人经过无数实验研究，首次提出了一种合成人工纳米酶的新方法，该方法是通过滚环扩增(RCA)构建具有周期性重复多聚腺嘌呤(polyA)茎环单元的长单链DNA框架(下文简称为DNA框架)，并以该DNA框架为模板，以茎环单元为生长位点，通过编码金纳米颗
粒的数量及空间间隔，以此构建催化活性可编程的纳米酶。本专利技术合成的纳米酶具有可编程的过氧化物酶催化活性，通过调节框架的序列长度及polyA单元间隔序列的长度、以及金前驱体的浓度等，可实现对纳米酶催化活性的调控。
[0026]本专利技术提供了一种纳米酶，所述纳米酶包括具有周期性重复多聚腺嘌呤茎环单元的单链DNA框架，以及在所述单链DNA框架的茎环单元上生长的金纳米本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳米酶，其特征在于，所述纳米酶包括单链DNA框架以及在所述单链DNA框架的茎环单元上生长的金纳米颗粒，所述单链DNA框架具有周期性重复多聚腺嘌呤茎环结构单元。2.如权利要求1所述的纳米酶，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述单链DNA框架的粒径为50
‑
450nm；2)所述单链DNA框架包括(i)连续的A碱基组成的环部、(ii)由(i)的两端的部分序列互补配对形成的茎部，(iii)间隔序列；其中所述(i)和(ii)组成茎环结构；所述A碱基的个数为X，X≥10；形成所述茎部的互补配对的碱基对数为Y，Y≥2；所述间隔序列的碱基的个数Z为3
‑
80nt；3)所述纳米酶具有过氧化物酶催化活性或类过氧化物酶催化活性；4)所述纳米酶为纳米球、纳米管或纳米棒中的一种或几种。3.如权利要求1或2所述的纳米酶，其特征在于，包括以下任一项：1)X为10
‑
50；2)Y为2
‑
30；3)Z为8
‑
50nt；4)所述单链DNA框架中包含的颈环结构的序列选自SEQ ID NO.10～12任一；优选地，所述单链DNA框架中包含的重复序列分别选自SEQ ID NO.7～9任一；进一步优选地，所述单链DNA框架的序列选自[CCCTAACCCTAACCCTAACCCGCATCCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGGATGC]
n
、[TCTAGGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCACGT]
n
、[AGTGGTGAATGTAAGGTGTATCAGAGCATCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGATGCGTAAGGTGTATCAGAAGTGGTAATC]
n
中的一种或几种，其中n≥1。4.如权利要求1～3任一项所述的纳米酶的合成方法，其特征在于，所述方法以具有周期性重复多聚腺嘌呤茎环单元的单链DNA框架为模板，以该单链DNA框架的茎环单元为生长位点，在其上生长金纳米颗粒，得到所述纳米酶。5.如权利要求4所述的纳米酶，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述单链DNA框架的粒径为50
‑
450nm；2)所述单链DNA框架包括(i)连续的A碱基组成的环部、(ii)由(i)的两端的部分序列互补配对形成的茎部，(iii)间隔序列；其中所述(i)和(ii)组成茎环结构；所述A碱基的个数为X，X≥10；形成所述茎部的互补配对的碱基对数为Y，Y≥2；所述间隔序列的碱基的个数Z为3
‑
80nt；3)所述单链DNA框架通过滚环扩增获得；4)所述生长金纳米颗粒的步骤包括：将所述单链DNA框架与金前驱体，在还原剂的作用下进行还原反应，使得金单质在所述单链DNA
框
架的茎环单元上进行生长。6.如权利要求5所述的合成方法，其特征在于，包括以下任一项：1)X为10
‑
50；2)Y为2
‑
30；3)Z为8
‑
50nt；4)所述单链DNA框架中包含的颈环结构的序列选自SEQ ID NO.10～12任一；优选地，所述单链DNA框架中包含的重复序列分别选自SEQ ID NO.7～9任一；进一步所述单链DNA框架的序列选自[CCCTAACCCTAACCCTAACCCGCATCCGAAAAAAAAA
A
AAAAAAAAAACGGATGC]
n
、[TCTAGGC
CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCACGT]
n
、[GATTACCACTTCTGATACACCTTACGCATCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGATGCTCTGATACACCTTACATTCACCACT]
n
中的一种或几种；其中n≥1。7.如权利要求5所述的合成方法，其特征在于，包括以下至少任一项：1)所述滚环扩增获得单链DNA框架的步骤包括：孵育包括环状DNA模板、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液的混合溶液，进行滚环扩增，获得所述单链DNA框架；2)所述金前驱体为氯金酸溶液；3)所述还原剂为弱还原剂；优选地，选自柠檬酸三钠、抗坏血酸、盐酸羟胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽华，陈晓亮，李江，樊春海，
申请(专利权)人：上海前瞻创新研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：