卵泡的冷冻保存和复苏方法技术

本发明专利技术涉及卵泡冻存技术领域，尤其涉及卵泡的冷冻保存和复苏方法。本发明专利技术提供的冷冻保存卵泡的方法首先对卵泡进行封装，水凝胶封装可以有效阻止冰晶向内生长，减少胞外冰损伤，降低渗透性保护剂浓度。且因水凝胶的隔离，在冻存液中添加纳米颗粒不会对卵泡产生毒性，而通过纳米颗粒对冻存的卵泡进行磁感应加热和光感应加热，可以使卵泡受热均匀，提高复苏效率，提高复苏后卵泡的存活率。并且，封装后水凝胶的三维网状结构类似于细胞外基质，可以用于复苏后腔前卵泡的体外培养。复苏后腔前卵泡的体外培养。

【技术实现步骤摘要】
卵泡的冷冻保存和复苏方法


[0001]本专利技术涉及卵泡冻存
，尤其涉及卵泡的冷冻保存和复苏方法。

技术介绍

[0002]近年来，一些恶性疾病(如乳腺癌、血液病)在年轻女性中发病率越来越高。虽然积极的化疗、放疗或骨髓移植可以治愈90％的女孩和年轻女性，但这些治疗仍然会损害性腺功能，甚至导致卵巢早衰。因此，对女性生育力保存的需求急剧增加。对于患某些特殊疾病(如急性白血病、卵巢癌)青春期前的女孩和急需癌症治疗的妇女来说腔前卵泡的冷冻保存是一种安全的选择。
[0003]卵泡的发育一般分为原始卵泡、初级卵泡、二级卵泡、三级卵泡及窦卵泡(窦卵泡也可以理解为成熟卵泡)。其中，二级卵泡、三级卵泡都属于窦前卵泡，窦前卵泡存在于所有年龄的个体的生殖腺中，可以从年轻或老年妇女的卵巢中获得。
[0004]目前普遍冻存的卵泡是指窦卵泡，方法就是主要包括慢速冷冻和玻璃化冷冻保存。与传统的慢速冷冻相比，玻璃化冷冻保存所需设备简单，容易操作，被认为是一种更有效的冷冻保存方法。玻璃化冷冻保存通常是用高浓度的低温保护剂在超低温环境下使细胞进入一种非结晶的玻璃化状态。但是，高浓度的渗透性低温保护剂(高达6～10mol/L)可能导致不可控的渗透损伤和生物毒性，从而严重影响保存的效果及卵泡后续的发育。此外，传统的复温方式是将冻存管置于37℃恒温水浴中，边摇动边被动复温。该方法复温速率不够快，会导致严重的反玻璃化和再结晶，这对于腔前卵泡来说是致命的。
[0005]因此迫切需要找到一种低浓度保护剂冷冻以及快速复温的方法来实现腔前卵泡的冷冻保存。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供低浓度保护剂冷冻以及快速有效复温的卵泡冷冻保存和复苏方法。
[0007]本专利技术提供的卵泡的冷冻保存方法，包括：以海藻酸钠凝胶封装卵泡后，移入保护液A中孵育，然后移入保护液B中再次孵育，浸入液氮进行冻存；
[0008]所述保护液A中包括冷冻保护剂；
[0009]所述保护液B中包括冷冻保护剂、Fe3O4纳米颗粒和GO纳米颗粒；
[0010]所述冷冻保护剂选自二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、海藻糖、乙酰胺或甲醇中一种或两种以上的组合。
[0011]本专利技术中，所述冷冻保护剂为乙二醇、丙二醇和海藻糖。
[0012]本专利技术中，所述Fe3O4纳米颗粒的直径为10～50μm。所述GO纳米颗粒的直径为200～400μm。
[0013]一些具体实施例中，，所述Fe3O4纳米颗粒的直径为20μm。所述GO纳米颗粒的直径为300μm。
[0014]本专利技术所述的冻存方法中，首先以水凝胶对卵泡进行封装。水凝胶微封装作为一个保护屏障，将腔前卵泡和纳米颗粒隔离，有效抑制了纳米颗粒的毒性。而且，水凝胶微胶囊可以有效阻止冰晶向内生长，减少胞外冰损伤，降低渗透性保护剂浓度。此外，水凝胶的三维网状结构类似于细胞外基质，可以用于复苏后腔前卵泡的体外培养。但由于水凝胶的硬度和浓度会影响腔前卵泡的体外发育，所以制备水凝胶时选取浓度低的海藻酸钠制备水凝胶。
[0015]本专利技术所述冷冻保存方法中，所述海藻酸钠凝胶封装卵泡包括：将卵泡与0.5wt％～2wt％海藻酸钠溶液混合，滴入0.1mol/L～0.5mol/L氯化钙溶液。
[0016]本专利技术所述封装步骤采用带喷嘴的离心管进行封装。离心管的体积为1.5mL，离心管的顶部设置有喷嘴，喷嘴的直径为100～500μm。离心管的喷嘴内装有浓度为0.5wt％～2wt％海藻酸钠溶液，离心管底部装有0.1mol/L～0.5mol/L氯化钙溶液。进行封装的步骤包括，将卵泡加入装海藻酸钠溶液的喷嘴中，经离心使喷嘴中的海藻酸钠溶液和卵泡在离心力作用下落入离心管底部的氯化钙溶液中，形成水凝胶微球。在上述海藻酸钠和氯化钙浓度和喷嘴的直径下，离心力为100
×
g～500
×
g制备的微球更稳定。
[0017]本专利技术所述冷冻方法中，将所述封装有卵泡的水凝胶微球转移至含有保护剂A的麦管中孵育20min后，再加入保护剂B孵育10min。
[0018]所述冷冻保存方法中，所述保护液A包括水和0.5mol/L～2mol/L乙二醇、0.5mol/L～2mol/L丙二醇和0.5mol/L～2mol/L的海藻糖。一些实施例中，所述保护液A由水和1mol/L乙二醇、1mol/L丙二醇和1mol/L海藻糖组成。
[0019]所述冷冻保存方法中，所述保护液B包括水和0.5mol/L～2mol/L乙二醇、0.5mol/L～2mol/L丙二醇、0.5mol/L～2mol/L的海藻糖、0.1wt％～1wt％Fe3O4纳米颗粒和0.01wt％～0.1wt％GO纳米颗粒。一些实施例中，所述保护液B由水和1mol/L乙二醇、1mol/L丙二醇、1mol/L的海藻糖、0.5wt％Fe3O4纳米颗粒和0.05wt％GO纳米颗粒。
[0020]本专利技术所述的保存液B随卵泡一同冻存，其中含有两种分别具有磁热(Fe3O4)和光热性质(GO)的纳米颗粒。两种纳米颗粒的浓度和配比可以任意调节，以获得适宜的升温速率。在37℃恒温水浴的基础上，通过结合了磁感应加热和光感应加热的纳米复温，实现了腔前卵泡低渗透性保护剂(1～3mol/L)的玻璃化冷冻保存。在复苏过程中，利用其中含有的Fe3O4纳米颗粒和GO纳米颗粒在磁感应加热和光感应加热的共同作用下，实现快速均匀的复温，提高卵泡的存活率。
[0021]本专利技术中，所述卵泡为窦前卵泡。窦前卵泡是卵泡的早期阶段，在卵巢皮质中占很大比例的卵泡，在保存、繁殖或研究方面具有巨大的潜力。
[0022]本专利技术所述冷冻保存方法获得冻存卵泡的复苏方法，包括：将冻存的卵泡置于37℃，进行磁感应加热和近红外加热。
[0023]本专利技术中，所述冻存的卵泡存在于麦管中，所述置于37℃为置于37℃的水中。
[0024]所述磁感应加热的电流为5A～30A，优选为15A。所述近红外加热的功率为1W/cm2～10W/cm2，优选为3W/cm2。
[0025]本专利技术所述复苏方法获得卵泡的体外培养方法，包括，将复苏后的细胞以培养基培养；所述培养基包括培养基A和培养基B。本专利技术提供的培养基A和培养基B对培养结果产生显著影响，其他培养基条件下，无法获得类似的培养效果。
[0026]本专利技术中，所述培养基A包括：α
‑
MEM、8％(v/v)～12％(v/v)FBS、80～120mIU/mL FSH、1
×
～2
×
ITS、800～1200IU/mL LIF和3～7μg/mL EGF。一些实施例中，所述培养基A包括：α
‑
MEM、10％(v/v)FBS、100mIU/mL FSH、1
×
ITS、1000IU/mL LIF和5μg/mL EGF。
[0027]本专利技术中，所述培养基B包括：α
‑
MEM、8％(v/v)～12％(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.卵泡的冷冻保存方法，包括：以海藻酸钠凝胶封装卵泡后，移入保护液A中孵育，然后移入保护液B中再次孵育，浸入液氮进行冻存；所述保护液A中包括冷冻保护剂；所述保护液B中包括冷冻保护剂、Fe3O4纳米颗粒和GO纳米颗粒；所述冷冻保护剂选自二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、海藻糖、乙酰胺或甲醇中一种或两种以上的组合。2.根据权利要求1所述的冷冻保存方法，其特征在于，所述海藻酸钠凝胶封装卵泡包括：将卵泡与0.5wt％～2wt％海藻酸钠溶液混合，滴入0.1mol/L～0.5mol/L氯化钙溶液。3.根据权利要求1所述的冷冻保存方法，其特征在于，所述保护液A包括水和0.5mol/L～2mol/L乙二醇、0.5mol/L～2mol/L丙二醇、0.5mol/L～2mol/L的海藻糖。4.根据权利要求1所述的冷冻保存方法，其特征在于，所述保护液B包括水和0.5mol/L～2mol/L乙二醇、0.5mol/L～2mol/L丙二醇、0.5mol/L～2mol/L的海藻糖、0.1wt％～1wt％Fe3O4纳米颗粒和0.01wt％～0.1wt％GO纳米颗粒。5.根据权利要求1～4任一项所述的冷冻保存方法，其特征在于，所述卵泡为窦前卵泡。6.权利要求1～5任一项所述冷冻保存方法获得冻存卵泡的复苏方...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵刚，田聪会，沈凌霄，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：