一种双斑东方鲀精巢组织细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种双斑东方鲀精巢组织细胞系及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术将双斑东方鲀的精巢进行分离培养，获得其原代细胞，并进行连续继代培养，最终建立稳定的双斑东方鲀精巢细胞TBTc。双斑东方鲀精巢细胞TBTc已于2021年10月11日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C2021230，该细胞系的细胞性状优良，以长纤维状细胞为主，分裂旺盛，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿。本发明专利技术的双斑东方鲀精巢细胞系为双斑东方鲀性腺发育机制研究提供了一种新的体外模型。机制研究提供了一种新的体外模型。

【技术实现步骤摘要】
一种双斑东方鲀精巢组织细胞系及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种双斑东方鲀精巢组织细胞系及其应用。

技术介绍

[0002]双斑东方鲀 (Takifugu bimaculatus)，属鲀形目，鲀科，东方鲀属，为近海暖温性底层鱼类，分布于我国南海、东海和黄海南部。其经济价值高、开发潜力大的水产珍品。建立鱼类细胞系能为鱼类病毒分离、抗病毒机制、疫苗研发、转基因技术、嵌合体组织工程等研究提供极大的便捷，且设施人力等资源的要求相对活体实验低，重复性好，研究周期短。细胞系为开展鱼类毒理、病理、遗传分析等研究提供了重要的体外模型。
[0003]目前关于双斑东方鲀细胞系的建立未见报道；仅有关于其他东方鲀属的部分细胞系的建立及少部分分离培养。王培军等采用组织块培养和细胞悬液培养暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）的肾脏组织对暗纹东方纯组织细胞的原代培养方法进行了研究和探索，但并没有达到预期的效果；Samuel等对星点东方鲀（Takifugu niphobles）和红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）的眼、大脑、肝脏、鳍、脾脏、肾脏、鳔和肌肉进行原代培养，其中眼细胞的生长速度最快，对两种河鲀的各种组织中衍生的细胞进行多次继代培养，红鳍东方鲀眼细胞在近一年的过程中已经连续培养维持超过60次继代。Zhang等（Zhang et al. Initiation of two ovarian cell lines from Fugu rubripes (Temminck et. Schlegel)[J]. 海洋学报(英文版), 2015. 701
‑
711.）从红鳍东方鲀卵巢中建立了称为TSOC1和TSOC2的细胞系，TSOC1由梭形上皮样细胞组成，而另一种由鹅卵石样细胞组成；并研究了包括温度，FBS浓度和pH在内的生长条件。Yang等已建立红鳍东方鲀精巢细胞系，命名为TRS，并证明了可有效地将外源基因或蛋白质传递到TRS中。
[0004]本研究将双斑东方鲀的精巢进行分离培养，获得其原代细胞，并进行连续继代培养，最终建立稳定的双斑东方鲀精巢组织细胞系，为双斑东方鲀性腺发育机制研究提供了一种新的体外模型。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对上述现有问题，提供一种双斑东方鲀精巢组织细胞系及其应用。本专利技术将双斑东方鲀的精巢进行分离培养，获得其原代细胞，并进行连续继代培养，最终建立稳定的双斑东方鲀精巢组织细胞系，为双斑东方鲀性腺发育机制研究提供了一种新的体外模型。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一株双斑东方鲀精巢组织细胞系，所述细胞系分类命名为双斑东方鲀精巢细胞TBTc，已于2021年10月11日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C2021230，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
[0007]一株双斑东方鲀精巢细胞系(TBTc)的构建方法，包括以下步骤：（1）双斑东方鲀精巢组织的获取：将7个月大，长8
‑
10cm的双斑东方鲀幼鱼在含三
抗的灭菌海水中暂养1
ꢀ‑ꢀ
2h，使用添加1wt
‰
次氯酸钠的灭菌海水对鱼体表面进行消毒15 min，然后滴入占灭菌海水体积0.005
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0.015%的丁香酚，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激应激无反应为止；以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，再以浸有酒精的纱布擦拭鱼体表面后，将鱼体移入超净台，用解剖器具取出性腺组织，取一部分放入多聚甲醛（PFA）中固定用于切片观察确定性腺组织为精巢组织，一部分于含三抗的PBS溶液中漂洗3
ꢀ‑ꢀ
4次用于原代细胞培养；上述三抗为三抗的100
ꢀ×
浓缩液：含10,000 U/mL青霉素、10,000 μg/mL链霉素及10,000 U/mL两性霉素B；三抗的灭菌海水：配制时每100 mL灭菌海水加入1 mL三抗的100
ꢀ×
浓缩液；含三抗的PBS溶液：100 mL PBS溶液加入1 mL三抗的100
ꢀ×
浓缩液；（2）组织切片：将双斑东方鲀精巢组织经固定、包埋、切片、染色后中性树胶封片保存，光学显微镜观察并拍照，（3）原代培养：将上述双斑东方鲀精巢组织切碎至1 mm3的小组织块，以PBS溶液漂洗2次；漂洗后将上述小组织块转移至15 mL离心管中，使用含三抗的PBS溶液清洗3次，小心吸去液体；
①
干贴法：将清洗干净的组织碎块在T25细胞培养瓶中均匀地铺开，倒置培养24 h后，小心加入5 mL完全培养液，继续培养；此期间每三天更换一半培养液；
②
单细胞接种法：向15 mL离心管中加入5 mL 0.25wt%胰酶消化组织块30 min来获得单细胞，并利用70 μm细胞过滤筛过滤消化的细胞，转移至15 mL离心管中，收集细胞沉淀，用5 mL完全培养液重悬细胞后接种于细胞培养瓶中，于27℃恒温培养启动原代培养，每2
ꢀ‑ꢀ
3天更换一半完全培养液；
③
半干贴法：向15 mL离心管中加入1 mL 0.25wt%胰酶消化组织块10 min后加入3 mL完全培养液，吹打均匀，将细胞和组织块同时接种至T25细胞培养瓶中，于27℃恒温培养启动原代培养，每2
ꢀ‑ꢀ
3天更换一半完全培养液；（4）传代培养：原代培养时由于细胞分布不均匀，单细胞局部产生接触抑制时，采用0.25wt%胰酶消化细胞，并向原培养瓶中加入5 mL完全培养基重悬细胞，待原瓶贴壁细胞增殖至80
‑
90%覆盖率时，移除旧培养液，加入5 mL含1vol%三抗的PBS溶液清洗1次；然后以0.25wt%胰酶消化法传代悬起细胞，以细胞悬液与完全培养液的体积比为1:2进行传代；以后每隔3
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4天传代一次，直至50代，成功建立双斑东方鲀精巢组织细胞系。优选的，其中细胞悬液与完全培养液的体积比为1:2。
[0008]上述完全培养液：以L
‑
15培养液为基础培养液，胎牛血清（FBS）、β
‑
巯基乙醇、N
‑
乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人碱性成纤维生长因子（Human FGF
‑ꢀ
basic）、人上皮细胞生长因子（Human EGF）、人肝细胞生长因子（Human HGF）、青霉素、链霉素、鱼血清与鱼胚提取物（TEE）的添加量分别为15vol%~20vol%、0.5vol
‰
、50 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/L、10 μg/L、2 μg/L、100 IU/mL、100 μg/mL、1vol%和1vol%。优选的，完全培养液中胎牛血清（FBS）的添加量为15vol%。
[0009]上述鱼血清的制备方法：用15% (w/v) EDTA浸润10 mL注射器，从双斑东方鲀成鱼的尾静脉取血到15 mL的置于冰上的离心管中。3,500g离心15 min，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株双斑东方鲀精巢组织细胞系，其特征在于：所述细胞系分类命名为双斑东方鲀精巢细胞TBTc，已于2021年10月11日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C2021230，保藏地址为中国武汉，武汉大学。2.一株双斑东方鲀精巢细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）双斑东方鲀精巢组织的获取：将7个月大，长8
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10cm的双斑东方鲀幼鱼在含三抗的灭菌海水，中暂养1
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2h，使用添加1wt
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次氯酸钠的灭菌海水对鱼体表面进行消毒15 min，然后滴入占灭菌海水体积0.005
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0.015%的丁香酚，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激应激无反应为止；以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，再以浸有酒精的纱布擦拭鱼体表面后，将鱼体移入超净台，用解剖器具取出性腺组织，取一部分放入多聚甲醛中固定用于切片确定性腺组织为精巢组织，一部分于含三抗的PBS溶液中漂洗3
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4次用于原代细胞培养；上述三抗为三抗的100
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浓缩液：含10,000 U/mL青霉素、10,000 μg/mL链霉素及10,000 U/mL两性霉素B；三抗的灭菌海水：配制海水时每100 mL灭菌海水加入1 mL三抗的100
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浓缩液；含三抗的PBS溶液：100 mL PBS液加入1 mL三抗的100
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浓缩液；（2）组织切片：将双斑东方鲀精巢组织经固定、包埋、切片、染色后中性树胶封片保存，光学显微镜观察并拍照，（3）原代培养：将上述双斑东方鲀精巢组织切碎至1 mm3的小组织块，以PBS溶液漂洗2次；漂洗后将上述小组织块转移至15 mL离心管中，使用含三抗的PBS溶液清洗3次，小心吸去液体；
①
干贴法：将清洗干净的组织碎块在T25细胞培养瓶中均匀地铺开，倒置培养24h后，小心加入5mL完全培养液，继续培养；此期间每三天更换一半培养液；
②
单细胞接种法：向15 mL离心管中加入5 mL 0.25wt%胰酶消化组织块30 min来获得单细胞，并利用70 μm细胞过滤筛过滤消化的细胞，转移至15 mL离心管中，收集细胞沉淀，用5 mL完全培养液重悬细胞后接种于细胞培养瓶中，于27℃恒温培养启动原代培养，每2
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3天更换一半完全培养液；
③
半干贴法：向15 mL离心管中加入1 mL 0.25wt%胰酶消化组织块10 min后加入3 mL完全培养液，吹打均匀，将细胞和组织块同时接种至T25细胞培养瓶中，于27℃恒温培养启动原代培养，每2
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3天更换一半完全培养液；（4）传代培养：原代培养时由于细胞分布不均匀，单细胞局部产生接触抑制时，采用0.25wt%胰酶消化细胞，并向原培养瓶中加入5 mL完全培养基重悬细胞，待原瓶贴壁细胞增殖至80
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90%覆盖率时，移除旧培养液，加入5 mL含1vol%三抗的PBS溶液清洗1次...

【专利技术属性】
技术研发人员：张子平，钟照威，王艺磊，姜永华，赵丽萍，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：