一种重组甘油激酶的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种重组甘油激酶的制备方法及应用，首先，获取甘油激酶基因和表达载体，并利用化学转化法将构建得到的甘油激酶基因表达载体导入受体菌株，得到甘油激酶表达菌株；然后，在37℃

【技术实现步骤摘要】
一种重组甘油激酶的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种重组甘油激酶的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]基因工程，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，又叫基因拼接技术或DNA重组技术。基因工程的基本操作步骤主要包括四步：
①
目的基因的获取；
②
基因表达载体的构建；
③
将目的基因导入受体细胞；
④
目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
[0003]甘油激酶(Glycerokinase，GK)是一个分子量为55KDa的蛋白，含有502个氨基酸残基。该酶主要应用于临床生化检测甘油三脂(TG)含量，血清中甘油三酯的含量是临床上诊断心血管系统疾病的重要指标，因为化学法测定存在诸多缺点，所以现在已陆续被酶联试剂盒所取代。甘油激酶(E.C 2.7.1.30)就是酶联试剂盒测定甘油三酯试剂盒中的关键酶之一，但酶联试剂盒对参与反应的酶纯度要求高，且对所含有的NADH氧化酶及过氧化氢酶等干扰酶也要求控制在很低的范围内，否则将影响试剂盒的测定结果。由于天然菌株甘油激酶表达较低且NADH氧化酶和过氧化氢酶很难被除去。
[0004]目前国外已有将甘油激酶基因的克隆表达并商品化的报道，而国内有关甘油激酶基因克隆高效表达的报道却甚少，虽然也有通过自然菌进行甘油激酶基因表达来实现甘油三酯试剂研制，但是自然菌存在产酶特性不稳定，且活性较低，导致制备得到的甘油激酶的综合性能很差。
专利技术内容
[0005]本专利技术的目的在于提供一种重组甘油激酶的制备方法及应用，提高甘油激酶的综合性能。
[0006]为实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种重组甘油激酶的制备方法，包括以下步骤：
[0007]获取甘油激酶基因和表达载体，并利用化学转化法将构建得到的重组甘油激酶基因表达载体导入受体菌株，得到重组甘油激酶表达菌株；
[0008]在37℃
‑
25℃及转速为180rpm
‑
200rpm的条件下，将所述重组甘油激酶表达菌株中任一单菌落进行诱导培养，并提取出蛋白粗提液；
[0009]利用镍柱对所述蛋白粗提液进行蛋白纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测得到的目的蛋白的纯度；
[0010]利用分光光度法检测甘油激酶的活力及浓度，并将检测合格的液体甘油激酶进行冷冻干燥，得到重组甘油激酶。
[0011]其中，获取甘油激酶基因和表达载体，并利用化学转化法将构建得到的重组甘油激酶基因表达载体导入受体菌株，得到重组甘油激酶表达菌株，包括：
[0012]获取NCBI数据库中大肠杆菌的甘油激酶基因序列，并进行基因合成，构建重组甘
油激酶基因表达载体；
[0013]利用化学转化法将所述重组甘油激酶基因表达载体导入受体菌株，得到重组甘油激酶表达菌株。
[0014]其中，利用化学转化法将所述重组甘油激酶基因表达载体导入受体菌株，得到重组甘油激酶表达菌株，包括：
[0015]将所述重组甘油激酶基因表达载体加入到具有100μL受体菌株的离心管中，在设定的弹力下，弹动管壁混匀后，冰上静置30min；
[0016]将所述离心管置于42℃水浴中，热激90s，然后转移到冰上静置5min；
[0017]向所述离心管中加入800μL LB培养基进行培养，然后涂布到具有抗生素的LB固体平板上，直至出现菌落，得到重组甘油激酶表达菌株。
[0018]其中，在37℃
‑
25℃及转速为180rpm
‑
200rpm的条件下，将所述重组甘油激酶表达菌株中任一单菌落进行诱导培养，并提取出蛋白粗提液，包括：
[0019]将所述重组甘油激酶表达菌株中任一单菌落接种于10mL LB液体培养基，并加入10uL卡那霉素(100mg/mL)或氨苄青霉素(100mg/mL)振荡混匀，在37℃，200rpm培养16h；
[0020]将所述培养基中的10mL菌液转移到含有1L LB的锥形瓶中，于37℃，180rpm培养至OD
600
＝0.6
‑
0.8；
[0021]加入终浓度为1mM/L IPTG或0.1％
‑
0.5％乳糖，在30℃
‑
37℃，180rpm，摇床诱导培养16h
‑
20h；
[0022]对诱导培养后的所述菌液进行预处理，得到蛋白粗提液。
[0023]其中，对诱导培养后的所述菌液进行预处理，得到蛋白粗提液，包括：
[0024]使用转速为8500rpm，对所述菌液离心10min，并在弃去培养上清后的菌体中加入20mM PB pH7.0
‑
pH7.6的缓冲液，进行一次洗涤；
[0025]向得到的菌体沉淀中加入平衡液重悬菌体，然后置于冰水混合物上超声破碎，并在10000rpm离心40min，收集离心上清，得到蛋白粗提液。
[0026]其中，利用镍柱对所述蛋白粗提液进行蛋白纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测得到的目的蛋白的纯度，包括：
[0027]利用洗杂缓冲液洗掉所述蛋白粗提液中的杂蛋白，并用5
‑
10倍镍柱柱体积洗脱目的蛋白，收集洗脱液；
[0028]利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测收集到的所述洗脱液中的所述目的蛋白的纯度。
[0029]第二方面，本专利技术提供了一种重组甘油激酶的应用，如第一方面所述的一种重组甘油激酶的制备方法制备得到的重组甘油激酶主要应用于甘油和甘油三酯的检测。
[0030]本专利技术的一种重组甘油激酶的制备方法及应用，首先，获取甘油激酶基因和表达载体，并利用化学转化法将构建得到的重组甘油激酶基因表达载体导入受体菌株，得到重组甘油激酶表达菌株；然后，在37℃
‑
25℃及转速为180rpm
‑
200rpm的条件下，将所述重组甘油激酶表达菌株中任一单菌落进行诱导培养，并提取出蛋白粗提液；接着，利用镍柱对所述蛋白粗提液进行蛋白纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测得到的目的蛋白的纯度；最后，利用分光光度法检测甘油激酶的活力及浓度，并将检测合格的液体甘油激酶进行冷冻干燥，得到重组甘油激酶，制备得到的重组甘油激酶主要应用于甘油和甘油三酯的检测，提高甘油激酶的综合性能。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0032]图1是本专利技术第一实施例提供的一种重组甘油激酶的制备方法的步骤示意图。
[0033]图2是本专利技术第二实施例提供的一种重组甘油激酶的制备方法的步骤示意图。
[0034]图3是本专利技术提供的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组甘油激酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：获取甘油激酶基因和表达载体，并利用化学转化法将构建得到的重组甘油激酶基因表达载体导入受体菌株，得到重组甘油激酶表达菌株；在37℃
‑
25℃及转速为180rpm
‑
200rpm的条件下，将所述重组甘油激酶表达菌株中任一单菌落进行诱导培养，并提取出蛋白粗提液；利用镍柱对所述蛋白粗提液进行蛋白纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测得到的目的蛋白的纯度；利用分光光度法检测甘油激酶的活力及浓度，并将检测合格的液体甘油激酶进行冷冻干燥，得到重组甘油激酶。2.如权利要求1所述的重组甘油激酶的制备方法，其特征在于，获取甘油激酶基因和表达载体，并利用化学转化法将构建得到的重组甘油激酶基因表达载体导入受体菌株，得到重组甘油激酶表达菌株，包括：获取NCBI数据库中大肠杆菌的甘油激酶基因序列，并进行基因合成，构建重组甘油激酶基因表达载体；利用化学转化法将所述重组甘油激酶基因表达载体导入受体菌株，得到重组甘油激酶表达菌株。3.如权利要求2所述的重组甘油激酶的制备方法，其特征在于，利用化学转化法将所述重组甘油激酶基因表达载体导入受体菌株，得到重组甘油激酶表达菌株，包括：将所述重组甘油激酶基因表达载体加入到具有100μL受体菌株的离心管中，在设定的弹力下，弹动管壁混匀后，冰上静置30min；将所述离心管置于42℃水浴中，热激90s，然后转移到冰上静置5min；向所述离心管中加入800μL LB培养基进行培养，然后涂布到具有抗生素的LB固体平板上，直至出现菌落，得到重组甘油激酶表达菌株。4.如权利要求1所述的重组甘油激酶的制备方法，其特征在于，在37℃
‑
25℃及转速为180rpm
‑
200rpm的条件下，将所述重组甘油激酶表达菌株中任一单...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦巧玲，叶志杰，黄艳妮，
申请(专利权)人：桂林英美特生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：