一种融合蛋白及其制备与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种融合蛋白，其从N端到C端依次包括：SEC2突变体、连接短肽和iNGR，所述SEC2突变体在如SEQ ID NO:18所示序列的第20、22、118和/或122位氨基酸残基发生突变，所述连接短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述iNGR的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。本发明专利技术还提供了该融合蛋白的制备方法和应用。本发明专利技术的靶向性融合蛋白可特异性靶向并浸润到肿瘤组织微环境，大幅度提升了超抗原的肿瘤特异性和血管通透性，提高了对肿瘤的杀伤效率，从而用于治疗患者时可有效提高患者的存活能力，具有良好的临床应用价值。有良好的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白及其制备与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种融合蛋白及其制备与应用。

技术介绍

[0002]肿瘤的免疫治疗，是指应用免疫学的原理和方法，通过激活体内的免疫细胞和增强机体抗肿瘤免疫应答，从而有效杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞生长的治疗方法。由于其副作用小、治疗效果明显，正逐渐成为未来肿瘤治疗的发展方向。
[0003]靶向性融合蛋白是在现代医学生物学发展的基础上提出的一种新型的治疗策略，由靶向分子和细胞毒性分子结合而成。靶向分子常选用肿瘤特异性抗体或短肽，将能够对目的细胞产生杀伤的效应分子递送至肿瘤患处，符合目前肿瘤精准治疗发展趋势。
[0004]iNGR是一种具有环状结构的靶向性穿膜肽，分子量较小，且具有较高的水溶性，序列为CRNGRGPDC，其中的NGR序列能够特异性地结合肿瘤组织血管内皮及肿瘤细胞高表达的整合素αv，然后被特定蛋白酶切割之后，残基片段具有R/KXXR/K的结构特点，能够与NRP
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1(神经纤毛蛋白
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1)相互作用，介导发生细胞膜穿透效应。iNGR因其功能多样而广泛应用于抗肿瘤药物、肿瘤成像剂以及一些生物制品等的靶向载体的研究。其中，整合素αv为细胞黏附受体家族成员，调节多种细胞功能，尤其是在实体瘤的发生、发展和转移，其表达也与肿瘤的恶性程度正相关。NRP
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1作为神经系统的调节因子，在肿瘤局部调节VEGF诱导血管生成中扮演重要的角色。其与肿瘤细胞的生长、迁移及血管生成等密切相关。
[0005]目前大部分研究都采用iNGR和化学药物进行联用，但化学药物需要用脂质体包载，之后才能与iNGR进行偶联，这类联合药物取得了不错的抑瘤效果。但是，由于脂质体包载的化学药物需要在组织内进行释放才能发挥药物作用，所以脂质体的类型、方式对药物效果有极大的影响。较低的脂质体包封率一直是困扰脂质体药物的关键，且脂质体类药物还存在稳定性较差，易被机体主动清除等问题。这样也导致了iNGR偶联的脂质体也存在结构及效果的不稳定等缺点，为其应用添加了阻碍。此外，在iNGR与化学药物联用的应用中，还有一些采用将iNGR与化学药物作为两个独立的部分混合给药，导致iNGR无法对化学药物发挥主动的靶向递送作用，仅能辅助部分聚集在肿瘤血管组织中的化药穿透进入肿瘤组织中。这不仅减弱了iNGR介导的效应分子在肿瘤局部的聚集效率，并且由于弱的靶向效果，导致化学药物对正常组织的毒副作用没有得到改善。
[0006]现有技术中还公开了将具有高渗透性的靶向性穿膜肽iNGR与其他TRAIL、CDD等蛋白类效应分子结合组成融合蛋白，取得的效果略佳。但是肿瘤脉管系统和肿瘤组织错综复杂，因此有待进一步寻求靶向性更强和组织穿透力更强的融合蛋白。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中融合蛋白不足以穿过肿瘤脉管系统和肿瘤组织复杂的微环境、导致抗肿瘤效果不够理想的技术缺陷，提供一种融合蛋白及其基因、其制备方法与应用。本专利技术将特定的靶向性穿膜肽与特定的超抗原通过特定
的连接短肽进行连接，形成的融合蛋白可特异性靶向并浸润到高表达整合素αv与NRP
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1的肿瘤组织微环境，大幅度提升了超抗原的肿瘤特异性和血管通透性，提高了对肿瘤的杀伤效率，从而用于治疗患者时可有效提高患者的存活能力，具有良好的临床应用价值。
[0008]本专利技术人对靶向分子、连接短肽、细胞毒性分子等进行了大量的研究，意外发现，当将靶向性穿膜肽iNGR与肿瘤免疫治疗药物超抗原中的SEC2突变体通过与连接短肽融合，配合特定的刚性的连接短肽(在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的连接短肽Linker，即连接肽的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原)时，所得融合蛋白的肿瘤特异性和血管通透性显著增强。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次包括：SEC2突变体、连接短肽和iNGR，所述突变包括1～4个氨基酸的插入、缺失或替换，所述SEC2的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述连接短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述iNGR的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0010]较佳地，所述SEC2突变体在如SEQ ID NO:18所示序列的第20、22、118和/或122位氨基酸残基发生突变(例如插入、缺失或替换)。
[0011]更佳地，所述SEC2突变体在如SEQ ID NO:18所示序列上具有T20L、G22E、H118A、H122A中的4、3、2或1个氨基酸取代。
[0012]更佳地，所述SEC2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11所示。
[0013]在某一较佳实施例中，所述SEC2突变体IAE
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1即是指超级抗原蛋白金黄色葡萄球菌肠毒素C2(Staphylococcal enterotoxin C2，SEC2，氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)的第20位氨基酸残基T突变为L，第22位氨基酸残基G突变为E，第118位氨基酸残基H突变为A的SAg IAE
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1异构体(本专利技术中均简称IAE
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1，如SEQ ID NO:3所示)。
[0014]在某一较佳实施例中，所述SEC2突变体IAE
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2即是指超级抗原蛋白金黄色葡萄球菌肠毒素C2(Staphylococcal enterotoxin C2，SEC2，氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)的第20位氨基酸残基T突变为L，第22位氨基酸残基G突变为E，第122位氨基酸残基H突变为A的SAg IAE
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2异构体(本专利技术中均简称IAE
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2，如SEQ ID NO:8所示)。
[0015]在某一较佳实施例中，所述SEC2突变体IAE
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3即是指超级抗原蛋白金黄色葡萄球菌肠毒素C2(Staphylococcal enterotoxin C2，SEC2，氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)的第20位氨基酸残基T突变为L，第22位氨基酸残基G突变为E，第118位氨基酸残基H突变为A，第122位氨基酸残基H突变为A的SAg IAE
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3异构体(本专利技术中均简称IAE
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3，如SEQ ID NO:11所示)。
[0016]所述SEC2突变体也可参考专利申请CN201010275279.6，在此引用其全部内容并入本专利技术。
[0017]较佳地，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10所示；更佳地，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端依次包括：SEC2突变体、连接短肽和iNGR，所述SEC2突变体在如SEQ ID NO:18所示序列的第20、22、118和/或122位氨基酸残基发生突变，所述连接短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述iNGR的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述SEC2突变体在如SEQ ID NO:18所示序列上具有T20L、G22E、H118A、H122A中的4、3、2或1个氨基酸取代；较佳地，所述SEC2突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11所示。3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10所示；较佳地，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9所示。4.一种融合基因，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的融合蛋白；较佳地，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9所示。5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含如权利要求4所述的融合基因；较佳地，所述重组表达载体的骨架载体为pET
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TEV。6.一种转化体，其特征在于，其通过在宿主中导入如权利要求4所述的融合基因或者如权利要求5所述的重组表达载体即得；较佳地，所述宿主为大肠杆菌，优选为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)细胞或者E.coli TG1。7.一种融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：(1)获得如权利要求6所述的转化体；(2)筛选所述转化体，表达并纯化所述融合蛋白。8....

【专利技术属性】
技术研发人员：徐明恺，张成刚，张惠文，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：