浓缩灌注培养基制造技术

本发明专利技术涉及一种无血清细胞培养灌注培养基，所述无血清细胞培养灌注培养基包含分组成至少三种单独的水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂，其中所得无血清细胞培养灌注培养基在混合后将pH调节至中性pH。还提供了一种制备所述无血清细胞培养灌注培养基的方法。本发明专利技术进一步涉及使用所述无血清细胞培养灌注培养基来在灌注培养中培养哺乳动物细胞或产生所关注蛋白质的方法，所述方法在低细胞比灌注速率下实现高生产率。本发明专利技术进一步涉及新的和改进的无血清细胞培养灌注培养基控制灌注细胞培养物的渗透压的用途，其中通过在细胞培养期间，例如在灌注细胞培养的生产阶段期间，抑制细胞生长，增加渗透压导致总生产率和/或细胞比生产率增加。抑制细胞生长特别减少或消除了对浪费的细胞排出的需要。对浪费的细胞排出的需要。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】浓缩灌注培养基


[0001]本专利技术涉及一种无血清细胞培养灌注培养基，所述无血清细胞培养灌注培养基包含分组成至少三种单独的水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂，其中所述无血清细胞培养灌注培养基在混合后将pH调节至中性pH。还提供了一种制备所述无血清细胞培养灌注培养基的方法。本专利技术进一步涉及使用所述无血清细胞培养灌注培养基来在灌注培养中培养哺乳动物细胞或产生所关注蛋白质的方法，所述方法在低细胞比(specific)灌注速率下实现高生产率。本专利技术进一步涉及新的和改进的无血清细胞培养灌注培养基控制灌注细胞培养物的渗透压的用途，其中通过在细胞培养期间，例如在灌注细胞培养的生产阶段期间，抑制细胞生长，增加渗透压导致总生产率和/或细胞比生产率(cell specific productivity)增加。抑制细胞生长特别减少或消除了对浪费的细胞排出的需要。

技术介绍

[0002]通常在通过哺乳动物细胞培养产生重组蛋白质的商业化过程中使用以下三种方法：分批培养、补料分批培养和灌注培养。
[0003]基于灌注的方法提供了优于分批和补料分批方法的潜在改进，其包括改进的产物质量和稳定性、改进的可扩展性和增加的细胞比生产率。与分批和补料分批生物反应器不同，灌注系统涉及连续去除用过的培养基。通过连续去除用过的培养基并将其用新培养基替换，可以更好地维持营养物水平，同时优化生长条件并去除细胞废物。减少的废物降低了对细胞和表达产物的毒性。因此，灌注生物反应器通常会显著减少蛋白质降解，并因此获得更高质量的产物。产物也可以更快、更连续地收获和纯化，这在产生不稳定的产物时特别有效。
[0004]灌注生物反应器也可更容易扩展。与传统的分批或补料分批系统相比，灌注生物反应器在可扩展性和/或不断增长的需求方面具有若干优势。一方面，灌注生物反应器尺寸更小，并且可以以更小的体积产生相同的生产率(即，产物产率)。一般认为，与补料分批生物反应器相比，灌注生物反应器可以在5至20倍的浓度下发挥作用。例如，100升灌注生物反应器可以产生与1,000升补料分批生物反应器相同的产物产率。因此，可以想象，1,000升灌注生物反应器的使用可以替代典型的10,000升传统补料分批生物反应器，并且不会对整体生产率产生负面影响。在扩大生产时，这种显著优势转化为更小的空间需求。这也可以转化为与较低的运营公用事业、较少的基础设施、较少的劳动力、降低的设备复杂性、连续收获以及提高的产物产率有关的一系列优势。
[0005]实现高细胞培养密度部分地说明了灌注系统更高生产率的原因。在典型的大规模补料分批商业化细胞培养过程中，可以实现10
‑
50x106个细胞/mL的细胞密度。然而，使用基于灌注的生物反应器，已经实现>1x108个细胞/mL的极端细胞密度。另外，在灌注模式下，通过连续补充用过的培养基，高细胞数目可以维持更长时间。在灌注生物反应器中，随着时间的增加，细胞密度越高，这部分地说明了灌注生物反应器的性能更有效的原因。
[0006]典型的灌注培养开始于分批培养启动，持续一天或更长时间，以实现快速的初始
细胞生长和生物量累积，随后连续、逐步和/或间歇地向培养物中添加新鲜的灌注培养基，并且同时去除用过的培养基，其中在整个培养生长和产生阶段都会保留细胞。在维持细胞的同时，可以使用如沉降、离心或过滤等各种方法来去除用过的培养基。已经采用的灌注流速为每天一小部分工作体积直至每天许多个工作体积。
[0007]虽然与传统的补料分批系统和分批系统相比，连续灌注系统具有众多优势，但在灌注生物反应器在生物制剂制造行业中得到更广泛的接受和利用之前，仍然存在许多挑战。例如，由于培养基的去除和补充的连续循环，因此灌注生物反应器比传统的补料分批系统消耗显著更大体积的培养基。具体而言，如果有可能的话，在中试规模(～100L生物反应器)之上，维持每天1
‑
3个容器体积(vvd)的灌注速率所需的培养基的体积变得在逻辑上具有挑战性。
[0008]WO 92/22637配制了基于物理化学性质分开的浓缩培养基亚组。然而，该浓缩培养基亚组在混合后不会调节pH，并且因此不适合于直接添加到细胞培养物中。此外，WO 92/22637中所公开的培养基，如基本培养基RPMI
‑
1640、DMEM和Ham's F
‑
12，不如现代细胞培养基丰富，其氨基酸浓度在mM工作浓度范围内而不是在μM工作浓度范围内。
[0009]连续灌注细胞培养系统面临的另一问题是维持恒定的活细胞密度以及因此更健康、更多产的细胞培养的挑战。这通常通过允许“细胞排出”来解决。在细胞排出期间，以足以允许稳态灌注细胞培养的速率去除细胞并将其作为废物丢弃。反过来，这使活细胞密度保持恒定。由于细胞排出技术，大部分培养基和产物可能会丢失，该技术虹吸出增殖细胞和培养基，以便在生物反应器内维持恒定的、可持续的活细胞密度。由于细胞排出技术，多达三分之一的可收获材料可能会丢失。因此，使用细胞排出会降低每次运行的产物产率，因为通过细胞排出去除的部分内的产物没有被收获。因此，任何量的细胞排出都会对过程效率、产物回收产生负面影响，并且最重要的是会导致产物损失。细胞排出速率通过细胞生长速率来确定。更快的倍增时间也需要更高的细胞排出以维持恒定的细胞密度，因此会产生更多的浪费。
[0010]作为细胞排出的替代方法，其他人尝试使用化学添加剂来减缓细胞生长速率。减少的细胞生长通常也会增加细胞比生产率。例如，Du et al.(Biotechnology and Bioengineering,Vol.112,No.1,January 2015)报道了使用小分子细胞周期抑制剂以控制生长和提高细胞培养生产率。相似的公开见于WO 2014/109858，其公开了CDK4抑制剂在如分批、补料分批和灌注培养等细胞培养中的用途。Du et al.进一步教导，CDK4/6抑制剂特异性地抑制细胞周期且不会影响其他细胞目标。然而，要避免添加细胞生长和/或细胞维持不需要的抑制剂和化合物。因此，有效抑制灌注状态下的细胞生长并避免对细胞排出的需要的额外方法将显著帮助推进本领域。
[0011]渗透压是影响细胞生长的已知杠杆。使用渗透压影响细胞生长的现有技术在文献(Zhu,et al(2005)Biotechnology Progress 21,70
‑
77；Han,Koo and Lee(2009)Biotechnology Progress 25,1440
‑
1447；Hu and Aunins(1997)Current Opinion in Biotechnology,148
‑
153)中是已知的。然而，特别是在灌注培养中，从未建立过将细胞培养过程控制到目标渗透压的能力。此外，化学添加剂影响培养基组成和/或需要在后续纯化步骤中清除，从而增加过程复杂性。包括盐在内的化学添加剂也可能影响产物质量。
[0012]鉴于灌注细胞培养面临的挑战，如制备本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基包含分组成至少三种单独的水性浓缩进料的培养基组分以及稀释剂，其中第一浓缩进料是碱性浓缩进料，第二浓缩进料是酸性浓缩进料，并且第三浓缩进料是近中性浓缩进料；其中在将所得无血清细胞培养灌注培养基中的所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基将pH调节至中性pH。2.如权利要求1所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中在将所述至少三种单独的水性浓缩进料和所述稀释剂混合后，所得无血清细胞培养灌注培养基的pH介于6.7至7.5之间、介于6.9至7.4之间，优选地介于6.9至7.2之间。3.如权利要求1或2所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述稀释剂是无菌水。4.如权利要求1至3中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基用于(a)将所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料单独添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中；(b)将所述碱性浓缩进料、所述酸性浓缩进料和所述近中性浓缩进料直接添加到细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中，无之前的预混合；和/或(c)将所述至少三种单独的水性浓缩进料在细胞培养物和/或生物反应器的反应容器中直接混合。5.根据前述权利要求中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述碱性浓缩进料是2x至80x浓缩进料，所述酸性浓缩进料是2x至40x浓缩进料，并且所述近中性浓缩进料是2x至50x浓缩进料。6.根据前述权利要求中任一项所述的经分隔开的无血清细胞培养灌注培养基，其中所述碱性浓缩进料的pH为9或更高，所述酸性浓缩进料的pH为5或更低，并且所述近中性浓缩进料的pH为7至8.5。7.一种碱性水性浓缩进料，所述碱性水性浓缩进料用于与酸性水性浓缩进料、近中性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所得无血清细胞培养灌注培养基的pH被自动调节至中性pH。8.一种酸性水性浓缩进料，所述酸性水性浓缩进料用于与碱性水性浓缩进料、近中性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所得无血清细胞培养灌注培养基的pH被自动调节至中性pH。9.一种近中性水性浓缩进料，所述近中性水性浓缩进料用于与碱性水性浓缩进料、酸性水性浓缩进料和稀释剂组合以形成无血清细胞培养灌注培养基，其中所得无血清细胞培养灌注培养基的pH被自动调节至中性pH。10.一种制备无血清细胞培养灌注培养基的方法，所述方法包含：(a)基于在碱性、酸性和中性pH下的溶解度，以组分的至少三种亚组提供细胞培养基组分，(b)(i)在碱性水溶液中溶解在碱性pH下可溶的亚组组分以形成碱性浓缩进料；
(ii)在酸性水溶液中溶解在酸性pH下可溶的亚组组分以形成酸性浓缩进料；以及(iii)在中性水溶液中溶解在中性pH下可溶的组亚组分以形成近中性浓缩进料；(c)任选地...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰国际公司，
类型：发明
国别省市：