用于配体依赖性转录调控的新型受体制造技术

本公开文本总体上尤其涉及一种新类别的被工程化为以配体依赖性方式调节转录调控的受体。特别地，所述新受体，虽然衍生自Notch，但不需要先前认为对于所述受体的功能是必需的Notch负调控区。本公开文本还提供了可用于产生此类受体的组合物和方法、编码此类受体的核酸、经所述核酸遗传修饰的宿主细胞、以及用于调节细胞的活性和/或用于治疗各种健康状况或疾病如癌症的方法。疾病如癌症的方法。疾病如癌症的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于配体依赖性转录调控的新型受体
关于联邦政府资助研发的声明
[0001]本专利技术是在由美国国立卫生研究院授予的授权号OD025751下在美国政府支持下完成的。政府拥有本专利技术中的某些权利。相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年9月24日提交的美国临时专利申请号62/905,248和2019年11月13日提交的美国临时专利申请号62/935,024的优先权，所述申请的公开内容通过引用以其整体(包含任何附图在内)并入本文。序列表的并入
[0003]本申请含有序列表，所述序列表通过引用以其整体特此并入。所附的名称为“048536_649001WO_Sequence_Listing_ST25.txt”的序列表文本文件创建于2020年9月23日，并且为92KB。


[0004]本公开文本总体上涉及结合细胞表面配体并且具有可选择的特异性和活性的新合成细胞受体。本公开文本还提供了可用于产生此类受体的组合物和方法、编码此类受体的核酸、经所述核酸遗传修饰的宿主细胞、以及用于调节细胞的活性和/或用于治疗各种健康状况或疾病如癌症的方法。

技术介绍

[0005]限制工程化细胞疗法在人中的开发的重要问题是调控治疗性基因表达以降低或消除引起关于嵌合抗原受体T细胞(CAR
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T)的施用的严重副作用的相互作用，所述副作用如例如，脱靶活性、中靶/脱肿瘤活性(即，其中CAR
‑
T靶标也发现于肿瘤外部的正常细胞上)以及不能在需要时调节或关闭CAR
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T活性。这些问题的可能的解决方案是使用能够修饰基因表达和/或细胞行为的替代性合成受体。
[0006]Notch受体是跨膜蛋白，其介导细胞间接触信号传导并且在发育和细胞间通讯(例如在两个接触细胞之间的通讯，其中一个接触细胞是“接收”细胞并且另一个接触细胞是“发送”细胞)的其他方面中发挥核心作用。在接收细胞中表达的Notch受体识别它们的在发送细胞上表达的配体(例如，delta/serrate/lag或“DSL”蛋白家族)。notch和delta在这些接触细胞上的接合导致notch受体的两步蛋白水解，其最终导致受体的胞内部分从膜释放到细胞质中。Notch具有通常被Notch负调控区(NRR)保护免于切割的金属蛋白酶切割位点(表示为“S2”)，所述Notch负调控区是由三个LIN
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Notch重复(LNR)模块和一个异二聚化结构域(HD)组成的结构域。认为这种蛋白水解通过发送细胞施加的力来调控：DSL配体拉动Notch受体，并且改变NRR的构象，从而暴露金属蛋白酶位点。然后该位点被组成型活性的蛋白酶切割，释放所述受体的胞外结合部分和负调控区。受体的配体结合部分的释放又暴露另外一个或多个切割位点(表示为“S3”)，所述切割位点被细胞膜内的γ分泌酶切割以从细胞膜释放核归巢胞内结构域。W.R.Gordon等人,Dev Cell(2015)33:729
‑
36。这种释放的结
构域通过作为转录调控因子发挥作用而改变接收细胞行为。Notch受体参与发育期间的多种细胞功能并且是所述细胞功能所需的，并且对于物种之间的众多种细胞类型的功能是重要的。
[0007]Notch受体的现有第一代合成衍生物(通常称为“SynNotch受体”)的例子通过以下方式来利用这种简单直接的信号传导行为：用抗体衍生物替代胞外配体结合结构域(其在野生型Notch中含有多个EGF样重复)，以及用选定的转录激活物替代胞质结构域，同时仍依赖于Notch NRR(L.Morsut等人,Cell(2016)164:780
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91)。通常，SynNotch信号传导与配体结合相关，但是难以调控受体的敏感性和反应。另外，NRR跨越大约160个氨基酸，使得仅此结构域就具有一些成熟蛋白质如胰岛素或表皮生长因子(EGF)的大小。这使所述受体的表达不太有效，并且由于与载体容量相关的大小约束，所得嵌合受体可能超过一些克隆和转染载体的容量。
[0008]本文引用的所有参考文献和专利都是通过引用整体特此并入，如同本文中充分陈述一般。

技术实现思路

[0009]本公开文本提供合成嵌合受体，令人惊讶地，虽然完全不存在Notch负调控区(NRR)，但所述合成嵌合受体仍发挥功能。此外，这些受体提供宽范围的敏感性，包括当在T细胞中表达时对T细胞激活程度敏感的受体。另外，通过省略Notch/SynNotch负调控区的一个或多个结构域，可以使编码本公开文本的受体的多核苷酸小于SynNotch编码多核苷酸，从而促进具有更有限容量的载体的使用，或者原本由于与载体容量相关的大小约束而被排除的另外的元件的包括。
[0010]在一个方面，本文提供嵌合多核苷酸，其从N末端到C末端包括：(a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；(b)连接序列；(c)包括一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域；以及(d)包括转录调控因子的胞内结构域，其中所述选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合诱导在所述转录调控因子与所述连接序列之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中嵌合多肽不包括Notch受体的LIN
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Notch重复(LNR)和/或异二聚化结构域(HD)。
[0011]根据本公开文本的嵌合多肽的非限制性示例性实施方案包含以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述跨膜结构域还包括停止转移序列(STS)。在一些实施方案中，所述胞外结构域包含能够结合至细胞表面上的配体的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述细胞是病原体。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述人细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述人细胞是终末分化细胞。在一些实施方案中，所述配体包括蛋白质或碳水化合物。在一些实施方案中，所述配体选自CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD34、CD40、CD45、CD48、CD52、CD59、CD66、CD70、CD71、CD72、CD73、CD79A、CD79B、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD94、CD95、CD134、CD140(PDGFR4)、CD152、CD154、CD158、CD178、CD181(CXCR1)、CD182(CXCR2)、CD183(CXCR3)、CD210、CD246、CD252、CD253、CD261、CD262、CD273(PD
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L2)、CD274(PD
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L1)、CD276(B7H3)、CD279、CD295、CD339(JAG1)、CD340(HER2)、EGFR、FGFR2、CEA、AFP、CA125、MUC
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1、MAGE、BC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种嵌合多肽，所述嵌合多肽从N末端到C末端包含：a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；b)连接多肽；c)包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域；以及d)包含转录调控因子的胞内结构域，其中所述选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合诱导设置在所述转录调控因子与所述连接多肽之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中所述嵌合多肽不包含Notch受体的LIN
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Notch重复(LNR)和/或异二聚化结构域(HD)。2.根据权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域还包含停止转移序列。3.根据权利要求1或2所述的嵌合多肽，其中所述胞外结构域包含能够结合至细胞表面上的配体的抗原结合部分。4.根据权利要求3所述的嵌合多肽，其中所述细胞是病原体。5.根据权利要求3所述的嵌合多肽，其中所述细胞是人细胞。6.根据权利要求5所述的嵌合多肽，其中所述人细胞是肿瘤细胞。7.根据权利要求5所述的嵌合多肽，其中所述人细胞是终末分化细胞。8.根据权利要求1至7中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体包括蛋白质或碳水化合物。9.根据权利要求1至8中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体选自CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD34、CD40、CD45、CD48、CD52、CD59、CD66、CD70、CD71、CD72、CD73、CD79A、CD79B、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD94、CD95、CD134、CD140(PDGFR4)、CD152、CD154、CD158、CD178、CD181(CXCR1)、CD182(CXCR2)、CD183(CXCR3)、CD210、CD246、CD252、CD253、CD261、CD262、CD273(PD
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L2)、CD274(PD
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L1)、CD276(B7H3)、CD279、CD295、CD339(JAG1)、CD340(HER2)、EGFR、FGF R2、CEA、AFP、CA125、MUC
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1、MAGE、胎盘碱性磷酸酶样蛋白2(ALPPL2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和信号调节蛋白α(SIRPα)。10.根据权利要求1至9中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体选自细胞表面受体、粘附蛋白、整合素、粘蛋白、凝集素、肿瘤相关抗原以及肿瘤特异性抗原。11.根据权利要求1至10中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。12.根据权利要求1至11中任一项所述的嵌合多肽，其中所述胞外配体结合结构域包含受体的配体结合部分。13.根据权利要求3至12中任一项所述的嵌合多肽，其中所述抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体、微型抗体、F(ab
′
)2片段、F(ab)片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(sdAb)及其功能片段。14.根据权利要求13所述的嵌合多肽，其中所述抗原结合部分包含scFv。15.根据权利要求3至14中任一项所述的嵌合多肽，其中所述抗原结合部分特异性结合至选自以下的肿瘤相关抗原：CD19、B7H3(CD276)、BCMA、CD123、CD171、CD179a、CD20、
CD213A2、CD22、CD24、CD246、CD272、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD46、CD71、CD97、CEA、CLDN6、CLECL1、CS
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1、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EpCAM、EphA2、肝配蛋白B2、FAP、FLT3、GD2、GD3、GM3、GPRC5D、HER2(ERBB2/neu)、IGLL1、IL
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11Ra、KIT(CD117)、MUC1、NCAM、PAP、PDGFR
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beta、PRSS21、PSCA、PSMA、ROR1、SSEA
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4、TAG72、TEM1/CD248、TEM7R、TSHR、VEGFR2、BCMA(CD269)、ALPPL2、ALPI、瓜氨酸化波形蛋白、cMet和Axl。16.根据权利要求15所述的嵌合多肽，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、CEA、HER2、MUC1、CD20、BCMA、ALPPL2或EGFR。17.根据权利要求16所述的嵌合多肽，其中所述肿瘤相关抗原是CD19。18.根据权利要求1至17中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体诱导型蛋白水解切割位点是γ分泌酶切割位点。19.根据权利要求1至18中任一项所述的嵌合多肽，其中所述转录调控因子包含转录激活物或转录阻遏物。20.根据权利要求1至19中任一项所述的嵌合多肽，其中所述胞内结构域包含核定位序列和选自以下的转录调控因子序列：Gal4
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VP16、Gal4
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VP64、tetR
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VP64、ZFHD1
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VP64、Gal4
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KRAB和HAP1
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VP16。21.根据权利要求1至20中任一项所述的嵌合多肽，所述嵌合多肽还包含信号序列、可检测标记、肿瘤特异性切割位点、疾病特异性切割位点及其组合。22.根据权利要求1至21中任一项所述的嵌合多肽，其中所述停止转移序列包含与SEQ ID NO:37
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45中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。23.根据权利要求1至22中任一项所述的嵌合多肽，其中所述连接多肽包含与SEQ ID NO:19
‑
27中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。24.根据权利要求23所述的嵌合多肽，其中所述连接多肽包含与SEQ ID NO:19
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27中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。25.根据权利要求24所述的嵌合多肽，其中所述连接多肽包含与SEQ ID NO:19
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27中的任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。26.根据权利要求25所述的嵌合多肽，其中所述连接多肽包含与SEQ ID NO:19
‑
27中的任一个基本上相同的氨基酸序列。27.根据权利要求1至26中任一项所述的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:28
‑
36中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。28.根据权利要求27所述的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:28
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36中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。29.根据权利要求1至28中任一项所述的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:28
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36中的任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。30.根据权利要求29所述的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:28
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36中的任一个基本上相同的氨基酸序列。31.根据权利要求1至30中任一项所述的嵌合多肽，其中：a)所述连接多肽包含与SEQ ID NO:19
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27中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；b)所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:28
‑
36中的任一个具有至少80％序列同一性的氨
基酸序列；并且c)所述停止转移序列结构域包含与SEQ ID NO:37
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【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：