遗传修饰真菌和与其相关方法和用途技术

本发明专利技术涉及工业生物技术、可再生原始材料和微生物生产生物体的领域。具体地说，本发明专利技术涉及生产乳酸或乳酸酯或一种或多种选自由聚合物、聚酯和聚乳酸组成的组的产物的方法。本发明专利技术还涉及包含增加的特定酶活性的遗传修饰真菌、制备所述遗传修饰真菌的方法、和所述真菌用于生产乳酸、乳酸酯或聚合物的用途。乳酸酯或聚合物的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】遗传修饰真菌和与其相关方法和用途
专利

[0001]本专利技术涉及工业生物技术、可再生原料材料和微生物生产生物体的领域。具体地说，本专利技术涉及生产乳酸或乳酸酯或一种或多种选自由聚合物、聚酯和聚乳酸组成的组的产物的方法。本专利技术还涉及包含增加的特定酶活性的遗传修饰真菌、制备所述遗传修饰真菌的方法、和所述真菌用于生产乳酸、乳酸酯或聚合物的用途。
[0002]专利技术背景
[0003]乳酸发酵是例如葡萄糖和其他己糖(六碳糖)或六碳糖的双糖(例如蔗糖或乳糖)藉以转化成能量和乳酸的厌氧代谢过程。目前在美国，乳酸由玉米淀粉生产，并且在其他地方，由诸如甜菜和甘蔗的其他糖来源生产。所述淀粉和糖来源主要包含简单碳水化合物。生产乳酸用于食物用途，但是也作为生产聚乳酸(PLA)的前体。PLA是越来越多地用于制造生物塑料的可再生聚合物。对于PLA生产来说，需要通常不由野生型微生物生产的光学纯异构体。
[0004]需要用于生产乳酸的更便宜和生态相容的原料。举例来说，细菌唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)已用于将大豆糖蜜转化成乳酸(Montelongo J等人,1993,Journal of food science,第58卷,863
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866)。然而，仍然存在对于能够将复杂碳水化合物诸如低聚半乳糖转化成乳酸的有效真菌的显著未满足的需要。
[0005]专利技术简述
[0006]本专利技术的目标，即获得生产乳酸和/或乳酸酯的有效方法以及获得能够有效地将碳水化合物转化成乳酸和/或乳酸酯的真菌通过使用真菌的遗传修饰来实现。
[0007]本专利技术使得能够克服现有技术的缺陷，包括但不限于缺乏能够将复杂碳水化合物(包括但不限于碳水化合物大豆糖蜜)转化成乳酸的真菌。事实上，与例如玉米淀粉和蔗糖相比，本专利技术的真菌和方法允许使用替代碳源物以工业规模生产乳酸。因此，本专利技术通过允许利用包含复杂碳水化合物的工业侧流来为生态发展提供价值。
[0008]目前，例如PLA的成本与合成塑料不具有竞争性。然而，本专利技术允许降低聚合物诸如PLA或聚酯的生产成本。
[0009]意外地，本专利技术的真菌和方法使得能够以有利于工业经济运行的高产率、滴度和生产力来生产纯L
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乳酸异构体。
[0010]本专利技术涉及生产乳酸和/或乳酸酯的方法，所述方法包括
[0011]提供经遗传修饰来增加乳酸脱氢酶和α
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半乳糖苷酶活性的真菌，
[0012]在包含碳源物(例如包含低聚半乳糖的碳源物)的培养基中培养所述真菌来获得乳酸和/或乳酸酯。
[0013]另外，本专利技术涉及包含增加的乳酸脱氢酶和α
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半乳糖苷酶活性的遗传修饰真菌。
[0014]本专利技术还涉及制备包含增加的乳酸脱氢酶和α
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半乳糖苷酶活性的本专利技术的遗传修饰真菌的方法，其中所述方法包括提供真菌和遗传修饰真菌来增加乳酸脱氢酶和α
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半乳糖苷酶活性。
[0015]此外，本专利技术涉及包含增加的乳酸脱氢酶和α
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半乳糖苷酶活性的本专利技术的真菌用
于生产乳酸和/或乳酸酯或用于生产聚合物，任选地聚酯或聚乳酸的用途。
[0016]并且此外，本专利技术涉及生产一种或多种选自由聚合物、聚酯和聚乳酸组成的组的产物的方法，所述方法包括在含有碳源物例如低聚半乳糖的培养基中培养本专利技术的遗传修饰真菌(包含增加的乳酸脱氢酶和α
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半乳糖苷酶活性)以便生产乳酸，回收所得乳酸和使用回收的乳酸来生产聚合物、聚酯和/或聚乳酸。
[0017]本专利技术的其他目标、细节和优势由以下附图、详细说明和实施例而变得显而易知。
[0018]附图简述
[0019]图1示出使用半乳糖作为唯一碳源，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和蜜生假丝酵母(Candida apicola)的各种野生型真菌菌株的生长。菌株的生长通过量化OD
600
来评估。
[0020]图2示出使用半乳糖作为唯一碳源，表达乳酸脱氢酶(ldh)的四种真菌菌株的生长。菌株的生长通过量化OD
600
来评估。
[0021]图3示出在具有1％蜜二糖或蜜三糖作为碳源的SC
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Ura培养基上，表达编码α
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半乳糖苷酶的不同基因的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株的生长。在30℃下，伴以220rpm振荡，菌株在24孔板中以4ml培养体积培养过夜。
[0022]图4示出来自亲代菌株(VTT
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C
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02453ura3Δ/ura3Δ)和表达不同α
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半乳糖苷酶的衍生菌株的1:3稀释大豆糖蜜的24h培养物的通过HPLC量化的乙醇滴度(g/L)。
[0023]图5示出来自亲代菌株(VTT
‑
C
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02453ura3Δ/ura3Δ)和表达不同α
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半乳糖苷酶的衍生菌株的1:3稀释大豆糖蜜的24h培养物的通过HPLC量化的残留糖(g/L)。
[0024]图6示出来自酿酒酵母E79
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4和表达不同α
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半乳糖苷酶的衍生菌株的生物反应器培养物的通过HPLC量化的乳酸(g/L)。菌株使用大豆糖蜜作为唯一碳源来生长。
[0025]图7示出来自酿酒酵母E79
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4和表达不同α
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半乳糖苷酶的衍生菌株的生物反应器培养物的量化残留低聚半乳糖(g/L)。菌株使用大豆糖蜜作为唯一碳源来生长。结果报告为蜜三糖、水苏糖、毛蕊花糖、蜜二糖、甘露三糖和甘露四糖的浓度的总和。
[0026]图8示出用于实施例1
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4中的质粒的图谱。
[0027]图9揭示来自使用大豆糖蜜作为修饰酵母菌株VTT C
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191026和表达额外不同α
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半乳糖苷酶基因拷贝的菌株的碳源的摇瓶培养物的量化残留四和三糖。
[0028]图10揭示来自使用大豆糖蜜作为修饰酵母菌株VTT C
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191026和修饰库德毕赤酵母(P.kudriavzevii)菌株VTT C
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201040的碳源的摇瓶培养物的量化所生产乳酸和残留三和二糖。
[0029]图11示出用于实施例6中的质粒的图谱。
[0030]序列表
[0031]SEQ ID NO:1：α
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半乳糖苷酶(黑曲霉(A.niger)aglC)之氨基酸序列
[0032]SEQ ID NO:2：α
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半乳糖苷酶(里氏木霉(T.reesei)agl1)之氨基酸序列
[0033]SEQ ID NO:3：α
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半乳糖苷酶(米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)GAL36)之氨基酸序列
[0034]S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产乳酸和/或乳酸酯的方法，所述方法包括提供被遗传修饰以便过度表达编码乳酸脱氢酶的基因和编码α
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半乳糖苷酶的基因的真菌，在包含有包含低聚半乳糖的碳源物的培养基中培养所述真菌以便获得乳酸和/或乳酸酯，其中所述碳源物包含大豆糖蜜。2.如权利要求1或2所述的方法，其还包括从所述培养基中回收所得乳酸和/或乳酸酯。3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括分离和/或纯化乳酸和/或乳酸酯。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳酸是光学纯乳酸异构体，任选地L
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乳酸异构体。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括从所获得的乳酸中制备聚乳酸。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碳源物包含占所述碳源物中的总碳水化合物的至少约10重量％、20重量％、30重量％、40重量％、50重量％、60重量％、70重量％、80重量％、或90％重量的低聚半乳糖。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述低聚半乳糖选自由以下组成的组：蜜二糖、甘露三糖、甘露四糖、蜜三糖、水苏糖、毛蕊花糖、ajucose、半乳糖肌醇、双半乳糖基肌醇、半乳糖松醇A、半乳糖松醇B、鹰嘴豆糖醇、荞麦醇B1、荞麦醇B2和其任何组合。8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碳源物包含葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、纤维素和/或其任何组合。9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碳源物包括来自豆类、大豆、蚕豆、豌豆、鹰嘴豆、玉米、甘蔗、甜菜、木质纤维素或其任何组合的碳源物；所述碳源物包含甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜和/或柑橘糖蜜；且/或所述培养基或碳源物包含5
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100重量％大豆糖蜜。10.一种用于从包含大豆糖蜜的碳源物中生产乳酸和/或乳酸酯的遗传修饰真菌，其中所述真菌被遗传修饰以便过度表达编码乳酸脱氢酶的基因和编码α
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半乳糖苷酶的基因。11.如前述权利要求中任一项所述的方法或遗传修饰真菌，其中所述α
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半乳糖苷酶是异源α
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半乳糖苷酶。12.如权利要求11所述的方法或遗传修饰真菌，其中所述异源α
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半乳糖苷酶是例如选自以下属类的酵母或丝状真菌的α
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半乳糖苷酶：曲霉(Aspergillus)、赤霉菌(Gibberella)、小克银汉霉(Cunninghamella)、镰刀菌(Fusarium)、球囊霉(Glomus)、腐质霉(Humicola)、被孢霉(Mortierella)、毛霉菌(Mucor)、青霉菌(Penicillium)、腐霉(Pythium)、根毛霉(Rhizomucor)、根霉(Rhizopus)、木霉(Trichoderma)和酵母属(Saccharomyces)，尤其由以下组成的组：玉米赤霉(Gibberella zeae)、中间赤霉(Gibberella intermdia)、串珠状赤霉(Gibberella moniliformis)、藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、尼加迈赤霉(Gibberella nygamai)、赤霉菌属F75、镰刀菌属2F75、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、芒果镰刀菌(Fusarium mangiferae)、层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)、轮状镰刀菌(Fusarium verticilloides)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、费氏曲霉(Aspergillus fischeri)、米黑根霉(Rhizopus miehei)、米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)、米根霉(Rhizopus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、长枝木霉
(Trichoderma longibrachiatum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。13.如前述权利要求中任一项所述的方法或遗传修饰真菌，其中所述乳酸脱氢酶是异源乳酸脱氢酶。14.如权利要求13所述的方法或遗...

【专利技术属性】
技术研发人员：西莫，
申请(专利权)人：FF未来公司，
类型：发明
国别省市：