经工程化的肿瘤选择性蛋白的表达制造技术

本公开提供了用于实现肿瘤选择性翻译的技术。使用两个互补的管道来研究本公开中所述的癌症细胞对比正常细胞的翻译景观，使得能够鉴定可用于工程化用于癌细胞特异性蛋白质表达的合成DNA或mRNA构建体的肿瘤选择性序列基序。本公开描述了肿瘤选择性基序的特征并提供了可用于编码具有高度治疗意义的有效载荷的模块化肿瘤选择性构建体设计的实施方案。模块化肿瘤选择性构建体设计的实施方案。模块化肿瘤选择性构建体设计的实施方案。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】96.)使用miR
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122和miR
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142靶位点插入分别将肝脏和脾脏中的体内mRNA活性降低了89％和85％(对应于约6
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10倍的降低)。然而，当肿瘤内注射时，经miRNA靶位点插入的mRNA的很大一部分也显示出被健康细胞(包括肿瘤浸润免疫细胞)吸收(Hewitt等人，Sci Transl Med.2019年1月30日；11(477))。免疫细胞中的这种活性对于编码细胞杀伤蛋白的mRNA的免疫肿瘤学应用可能产生相反效果。
[0011]本公开特别地确定了用于评定可有助于翻译通读的序列元件的某些现有技术的问题的根源。核糖体分析尤其已被用于推断翻译通读。然而，核糖体分析对减慢或停止核糖体的RNA序列和结构有偏差。因此，这些事件当单独使用时可能有过多的代表，并导致对通读效率的不准确测定。另一方面，基于LC/MS的蛋白质组学方法虽然没有RNA水平伪影，但是具有高假阴性率，因为它可能会遗漏具有低可飞行性(即低电离、转移和检测效率)或丰度的肽。因此，本公开尤其描述了用于评定可有助于翻译通读的序列元件的技术的新颖用途。
[0012]在一些实施方案中，当与合适的可比较的非癌细胞相比，翻译优选发生在癌细胞中时，本公开认为翻译是“肿瘤选择性的”。例如，在一些实施方案中，当观察到与适当的可比较的非癌细胞相比，癌细胞中的翻译是至少两(2)倍高时，可以认为翻译是肿瘤选择性的；在一些实施方案中，与适当可比较的非癌细胞相比，癌细胞中的肿瘤选择性翻译可以是至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍或更多倍高。
[0013]在一些实施方案中，肿瘤选择性翻译可被认为是肿瘤特异性的(例如，当翻译在适当的可比较的非癌细胞中不可检测，但在相关癌细胞中可检测时)。
[0014]在一些实施方案中，本公开提供了经工程化的核酸，所述经工程化的核酸的核苷酸序列包含序列元件，该序列元件是肿瘤选择性翻译序列元(或是肿瘤选择性翻译序列元的互补序列)。因此，在一些实施方案中，本公开提供了为或递送可翻译核酸(例如，RNA，特别是mRNA)的技术，该可翻译核酸包含如本文所述的肿瘤选择性翻译序列元件和/或以其他方式显示有效载荷序列的肿瘤选择性翻译。
[0015]在一些实施方案中，本公开提供了一种经工程化的核酸，所述经工程化的核酸的核苷酸序列包含序列元件，该序列元件是肿瘤选择性翻译序列元件或是肿瘤选择性翻译序列元件的互补序列。在一些实施方案中，经工程化的核酸的核苷酸序列包含开放阅读框或其互补序列。在一些实施方案中，肿瘤选择性翻译序列元件是或包含在开放阅读框内或上游的肿瘤选择性通读基序。在一些实施方案中，肿瘤选择性通读基序包含上游侧翼序列、终止密码子和下游侧翼序列。
[0016]在一些实施方案中，肿瘤选择性通读基序在跨越通读终止密码子和下游侧翼序列的前14个核苷酸的区域内包含选自包括以下的组的序列：VNNNNNNMNNMWK、NNNVWNNKGHHNH、DVHVNNNCWNNNB、MWBNNNNNNNNNN、WGNNSNHNHDNNN、VNNNNNNMNNMWK或VMNNWNKNNNNNN，其中V代表A、C或G，M代表A或C，W代表A或T/U，K代表G或T/U，H代表A、C或T/U，D代表A、G或T/U，B代表C、G或T/U，S代表G或C，N代表任何核苷酸。在一些实施方案中，肿瘤选择性通读基序包含茎环；凸环、假结或它们的组合，所述凸环、假结或它们的组合在下游侧翼序列的前50个核苷酸内并且是该茎环的部分，优选位于终止密码子内和下游侧翼序列的前16个核苷酸内，或它们的组合。在一些实施方案中，茎环在下游侧翼序列的前50个核苷酸内包含超过20个碱基配对的核苷酸。
[0017]在一些实施方案中，肿瘤选择性通读基序包含具有大于42％、大于48％、优选大于
54％的GC含量的下游侧翼序列。在一些实施方案中，肿瘤选择性通读基序包含编码脯氨酸残基的密码子。在一些实施方案中，经工程化的核酸的开放阅读框编码自杀蛋白。在一些实施方案中，经工程化的核酸具有降低的免疫原性。
[0018]在一些实施方案中，本公开提供了一种核酸，所述核酸的序列包含开放阅读框或其互补序列，在该开放阅读框或其互补序列中或之前已经工程化了肿瘤选择性通读基序，其中该开放阅读框编码选自由以下组成的组的有效载荷蛋白：自杀蛋白、细胞表面抗原、抗体剂、毒素、遗传修饰蛋白、或病毒复制蛋白。在一些实施方案中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含经工程化的核酸，所述经工程化的核酸的核苷酸序列包含序列元件，该序列元件是肿瘤选择性翻译序列元件或是肿瘤选择性翻译序列元件的互补序列。在一些实施方案中，该药物组合物包含纳米粒子。在一些实施方案中，经工程化的核酸在细胞中表达，使得药物组合物的施用将RNA递送至细胞。
[0019]在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的经工程化的核酸，所述经工程化的核酸的核苷酸序列包含序列元件，所述序列元件为肿瘤选择性翻译序列元件，或者是肿瘤选择性翻译序列元件的互补序列；或者施用治疗有效量的包含所述经工程化的核酸的药物组合物。在一些实施方案中，所治疗的受试者的癌症包含致癌核糖体。在一些实施方案中，致癌核糖体包含p53活性丧失、RB活性丧失、FBL过表达或核糖体蛋白基因半合子丧失中的至少一者。
[0020]在一些实施方案中，本公开提供了一种肿瘤选择性翻译序列元件，所述肿瘤选择性翻译序列元件包含通读共有序列、具有高G
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C含量的序列；编码脯氨酸的密码子；茎环；凸环、假结或它们的组合。在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴定肿瘤选择性核酸序列的方法，所述方法包括全转录组翻译组分析。在一些实施方案中，本公开提供了一种通过在开放阅读框内或之前插入通读基序来工程化肿瘤选择性核酸的方法。
附图说明
[0021]图1是示例性肿瘤选择性通读基序的示意图。每个基序包含上游侧翼序列、终止密码子和下游侧翼序列。上游侧翼序列(约60个核苷酸)在密码子的第3(摆动)位内具有高GC含量。下游侧翼序列(约50个核苷酸)具有高GC含量、前10
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12个核苷酸内的线性共有序列、和茎环结构(或另一稳定的RNA结构)。
[0022]图2是U1n到U10n的构建体图谱。每个构建体都含有7
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甲基鸟苷帽、5'UTR、编码区、3'UTR和聚A尾(在转录后添加的)。编码区包含起始密码子(ATG/AUG)、通读(RT)基序、自切割肽和缺少第一ATG/AUG的纳米荧光素酶编码区(开放阅读框)。这种模块化设计允许快速替换经编码的基因，与此同时保留载体主链和RT基序。
[0023]图3示出了测试构建体的翻译活性。在转染前24小时接种健康细胞(HUVEC)和癌细胞(NCI
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H1299)。将脂质体配制的构建体(U1n至U10n)在室温下孵育15分钟，然后添加到细胞培养基中。在16小时后测量纳米荧光素酶活性。转染一式三份执行，并且数据本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种经工程化的核酸，所述经工程化的核酸的核苷酸序列包含序列元件，所述序列元件是肿瘤选择性翻译序列元件或是肿瘤选择性翻译序列元件的互补序列。2.如权利要求1所述的经工程化的核酸，其中所述经工程化的核酸的核苷酸序列包含开放阅读框或其互补序列。3.如权利要求2所述的经工程化的核酸，其中所述肿瘤选择性翻译序列元件是或包含在所述开放阅读框内或上游的肿瘤选择性通读基序。4.如权利要求3所述的经工程化的核酸，其中所述肿瘤选择性通读基序包含上游侧翼序列、终止密码子和下游侧翼序列。5.如前述权利要求中任一项所述的经工程化的核酸，其中所述肿瘤选择性通读基序跨越所述通读终止密码子和所述下游侧翼序列的前14个核苷酸的区域内包含选自包括以下的组的序列：VNNNNNNMNNMWK、NNNVWNNKGHHNH、DVHVNNNCWNNNB、MWBNNNNNNNNNN、WGNNSNHNHDNNN、VNNNNNNMNNMWK或VMNNWNKNNNNNN，其中V代表A、C或G，M代表A或C，W代表A或T/U，K代表G或T/U，H代表A、C或T/U，D代表A、G或T/U，B代表C、G或T/U，S代表G或C，N代表任何核苷酸。6.如前述权利要求中任一项所述的经工程化的核酸，其中所述肿瘤选择性通读基序包含茎环；凸环、假结或它们的组合，所述凸环、假结或它们的组合在所述下游侧翼序列的前50个核苷酸内并且是所述茎环的部分，优选位于终止密码子内和所述下游侧翼序列的前16个核苷酸内，或它们的组合。7.如前述权利要求中任一项所述的经工程化的核酸，其中茎环包含所述下游侧翼序列的前50个核苷酸内的大于20个碱基配对的核苷酸。8.如前述权利要求中任一项所述的经工程化的核酸，其中所述肿瘤选择性通读基序包含具有大于42％、大于48％、优选大于54％的GC含量的下游侧翼序列。9.如前述权利要求中任一项所述的经工程化的核酸，其中肿瘤选择性通读基序包含编码脯氨酸残基的密码子。10.如前述权利要求中任一项所述的经工程化的核酸，其中所述开放阅读框编码自杀蛋白。11.如权利要求10所述的经工程化的核酸，其中所述自杀蛋白诱导坏死性凋亡。12.如权利要求11所述的经工程化的核酸，其中所述自杀蛋白是组成型活性MLKL。13.如权利要求10所述的经工程化的核酸，其中所述自杀蛋白诱导细胞焦亡。14.如权利要求13所述的经工程化的核酸，其中所述自杀蛋白是组成型活性消皮素D。15.如权利要求1所述的经工程化的核酸，其中所述经工程化的核酸具有降低的免疫原性。16.一种核酸，所述核酸的序列包含开放阅读框或其互补序列，在所述开放阅读框或其互补序列中或之...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y，
申请(专利权)人：科纳勒生物公司，
类型：发明
国别省市：