一种通过调节NGN3表达促进iPSC向胰岛细胞分化的方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种通过调节NGN3表达促进iPSC向胰岛细胞分化的方法。具体地，本发明专利技术通过在诱导细胞分化过程中梯度浓度添加重组人激活素A(Activin A)和添加CK

A method to promote IPSC differentiation into islet cells by regulating Ngn3 expression

【技术实现步骤摘要】
一种通过调节NGN3表达促进iPSC向胰岛细胞分化的方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种通过调节NGN3表达促进iPSC向胰岛细胞分化的方法。

技术介绍

[0002]胰岛β细胞(即胰岛B细胞)是胰岛细胞的一种，属内分泌细胞，约占胰岛细胞总数的70％，主要位于胰岛中央部，能分泌胰岛素，起调节血糖含量的作用。胰岛β细胞功能受损，胰岛素分泌绝对或相对不足，会引发糖尿病，其中1型糖尿病的病因主要就是由于患者自身免疫系统的缺陷对产生胰岛素的胰岛β细胞造成破坏，导致身体无法产生足够的胰岛素。
[0003]胰岛细胞移植作为治疗糖尿病的方法，在以基础研究为指导的临床应用中，相对于胰腺移植、胰岛移植表现出独特的优势，但是其远期效果不尽理想。目前主要靠从脑死亡供体获得胰岛细胞移植给患者，但由于个体差异，从每个供体获得的胰岛细胞数量并不稳定，一般需要2
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3个供体提取的胰岛细胞移植给一名患者，且由于排斥反应和胰岛血供、氧供不足等问题，移植到体内的胰岛细胞会随着时间不断流失。也就是说，胰岛细胞移植面临远期效果差和供体器官严重短缺的挑战。
[0004]因此，开发iPSC细胞分化为胰岛β细胞的方法为糖尿病的细胞疗法提供了广阔前景。目前的分化方案通常使用各种生长因子或小分子来模拟胰腺β细胞的发育，并通过各种中间状态(定型内胚层、原始肠管、后前肠、胰腺祖细胞和内分泌祖细胞)逐渐诱导iPSC生成胰岛素产生细胞(胰岛β细胞)。但目前诱导胰岛β细胞面临问题，主要包括：1，生成β细胞效率较低；2，生成的细胞通常是异质性的，含有许多不需要的细胞类型，包括大量的胰岛素和胰高血糖素双激素阳性细胞。
[0005]Ngn3位于10号染色体上，是由214个氨基酸组成的多肽序列，属于碱性螺旋
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环
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螺旋(basic helix
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loop
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helix，BHLH)结构类转录因子，它是内分泌干细胞基因转录的激活因子。在胰腺发育中，胰腺内的小部分胰腺干细胞表达Ngn3后，分化成为具有内分泌作用的胰岛细胞，聚集形成胰岛。NGN3对胰腺内分泌细胞的发育及分化至关重要，被认为是胰腺祖细胞的标志蛋白。
[0006]所以通过调节NGN3表达对促进iPSC向胰岛细胞分化，从而制备大量胰岛细胞并应用于临床治疗糖尿病具有重要意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于通过精准的调控NGN3的表达，提高iPSC向胰腺祖细胞分化效率，降低双激素(胰岛素和胰高血糖素双激素)阳性细胞比例，提高胰岛细胞成熟度。
[0008]本专利技术的诱导方案中包括1)梯度添加重组人激活素A(Activin A)，梯度浓度即第一天115ng/mL，第二天110ng/mL，第三天100ng/mL，可有效提高NGN3的表达，增加iPSC向胰腺祖细胞分化效率；2)添加CK
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666，抑制细胞黏附，进一步上调NGN3表达，促进iPSC向胰岛
细胞分化。
[0009]培养基组合
[0010]第一方面，本专利技术提供了一种培养基组合，所述培养基组合包括以下培养基：
[0011]1)第一培养基A：由重组人激活素A(Activin A)、CHIR
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99021、脱脂BSA(胎牛白蛋白)(BSA)、葡萄糖、谷氨酰胺(GlutaMax)、碳酸氢钠、基础培养基组成；
[0012]优选地，所述重组人激活素A的工作浓度为115ng/mL，所述CHIR
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99021的工作浓度为3μM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5％，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
[0013]2)第一培养基B：由重组人激活素A(Activin A)、CHIR
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99021、脱脂BSA(胎牛白蛋白)(BSA)、葡萄糖、谷氨酰胺(GlutaMax)、碳酸氢钠、基础培养基组成；
[0014]优选地，所述重组人激活素A的工作浓度为110ng/mL，所述CHIR
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99021的工作浓度为3μM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5％，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
[0015]3)第一培养基C：由重组人激活素A(Activin A)、CHIR
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99021、脱脂BSA(胎牛白蛋白)(BSA)、葡萄糖、谷氨酰胺(GlutaMax)、碳酸氢钠、基础培养基组成；
[0016]优选地，所述重组人激活素A的工作浓度为100ng/mL，所述CHIR
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99021的工作浓度为3μM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5％，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
[0017]4)第二培养基：由抗坏血酸、成纤维细胞生长因子7(FGF
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7)、脱脂BSA(胎牛白蛋白)(BSA)、葡萄糖、谷氨酰胺(GlutaMax)、碳酸氢钠、基础培养基MCDB131组成；
[0018]优选地，所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述成纤维细胞生长因子7(FGF
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7)的工作浓度为50ng/mL，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5％，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；
[0019]5)第三培养基：由抗坏血酸、成纤维细胞生长因子7(FGF
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7)、SANT
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1、视黄酸、LDN193189、胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物TPPB、脱脂BSA(胎牛白蛋白)(BSA)、葡萄糖、谷氨酰胺(GlutaMax)、碳酸氢钠、基础培养基MCDB131组成；
[0020]优选地，所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述成纤维细胞生长因子7(FGF
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7)的工作浓度为50ng/mL，所述SANT
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1的工作浓度为0.25μM，所述视黄酸的工作浓度为1μM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5％，所述蛋白激酶C活化物TPPB的工作浓度为200nM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2％，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为2.5g/L；
[0021]6)第四培养基：由抗坏血酸、成纤维细胞生长因子7(FGF
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7)、SANT
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1、视黄酸、LDN193189、胰岛素
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转铁蛋白
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养基组合，所述培养基组合包括以下培养基：1)第一培养基A：由重组人激活素A、CHIR
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99021、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；优选地，所述重组人激活素A的工作浓度为115ng/mL，所述CHIR
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99021的工作浓度为3μM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5％，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；2)第一培养基B：由重组人激活素A、CHIR
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99021、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；优选地，所述重组人激活素A的工作浓度为110ng/mL，所述CHIR
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99021的工作浓度为3μM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5％，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；3)第一培养基C：由重组人激活素A、CHIR
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99021、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；优选地，所述重组人激活素A的工作浓度为100ng/mL，所述CHIR
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99021的工作浓度为3μM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5％，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；4)第二培养基：由抗坏血酸、FGF
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7、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；优选地，所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述FGF
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7的工作浓度为50ng/mL，所述胎牛白蛋白的工作浓度为0.5％，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L；5)第三培养基：由抗坏血酸、FGF
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7、SANT
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1、视黄酸、LDN193189、胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物TPPB、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；优选地，所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述FGF
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7的工作浓度为50ng/mL，所述SANT
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1的工作浓度为0.25μM，所述视黄酸的工作浓度为1μM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5％，所述蛋白激酶C活化物TPPB的工作浓度为200nM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2％，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为2.5g/L；6)第四培养基：由抗坏血酸、FGF
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7、SANT
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1、视黄酸、LDN193189、胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物TPPB、胎牛白蛋白、葡萄糖、谷氨酰胺、碳酸氢钠、基础培养基组成；优选地，所述抗坏血酸浓度的工作浓度为0.25mM，所述FGF
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7的工作浓度为2ng/mL，所述SANT
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1的工作浓度为0.25μM，所述视黄酸的工作浓度为1μM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5％，所述蛋白激酶C活化物TPPB的工作浓度为200nM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2％，所述葡萄糖的工作浓度为10mM，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述碳酸氢钠的工作浓度为2.5g/L；7)第五培养基：SANT
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1、视黄酸、LDN193189、胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋
白、基础培养基组成；优选地，所述SANT
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1浓度的工作浓度为0.25μM，所述视黄酸的工作浓度为0.1μM，所述LDN193189的工作浓度为100nM，所述胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5％，所述三碘甲状腺原氨酸的工作浓度为1μM，所述ALK5抑制剂ALK5i II的工作浓度为10μM，所述硫酸锌的工作浓度为10μM，所述肝素的工作浓度为10μg/mL，所述碳酸氢钠的工作浓度为1.5g/L，所述谷氨酰胺的工作浓度为2mM，所述葡萄糖的工作浓度为20mM，所述胎牛白蛋白的工作浓度为2％；优选地，所述培养基组合还包括以下培养基：8)第六培养基A：由细胞黏附抑制剂CK
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666、LDN193189、胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、γ
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分泌酶抑制剂GSi XX、肝素、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛白蛋白、基础培养基组成；优选地，所述培养基中CK
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666的工作浓度为100μM，所述LDN193189的工作浓度为100nM；所述胰岛素
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转铁蛋白
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硒
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乙醇胺添加剂的工作浓度为0.5％；所述三碘甲状腺原氨酸的工作...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贯乔，顾雨春，安翠平，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：