一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基、配制方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种微生物筛选用培养基，特别涉及一种用于分离耐受牛胆汁的高效牛黄转化细菌的培养基、配制方法及应用。所述培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量1000.0ml的量，还含有牛肝提取物100.0g～300.0g、牛肾提取物100.0g～300.0g、蛋白胨5.0g～15.0g、葡萄糖3.0g～5.0g、NaCl 3.0g～5.0g、磷酸氢二钠3.0g～5.0 g、牛胆汁100.0ml～600.0 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂10.0g～30.0g，调节pH 6.8～7.5。应用本发明专利技术的培养基所分离筛选的菌种具有能够长时间耐受牛胆汁、牛黄转化效率高的特点。率高的特点。率高的特点。

Screening medium, preparation method and application of bezoar transforming bacteria resistant to bovine bile

【技术实现步骤摘要】
一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基、配制方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种微生物筛选用培养基，特别涉及一种用于分离耐受牛胆汁的高效牛黄转化细菌的培养基、配制方法及应用。

技术介绍

[0002]牛黄是牛科动物牛（Bostaurus domestlcus Gmel）或水牛（Bubalus bubalisl）在病理状况下于其胆囊或胆管内形成的结石的干燥品，属于名贵中药之一，具有清心、开窍、镇惊、清热、解毒等多种临床功效。我国4500种中成药约有650种含有牛黄，我国牛群中天然牛黄的出现率仅为0.21 %，自然产量十分稀少，自古皆有“药中之贵，莫复过此”之说。上世纪90年代蔡红娇教授首先研制出了体外培育牛黄（CN1022668C，CN1044402A，CN1041105A），并收录于中国药典（2020版）中，它是以牛新鲜胆汁作母液，加入去氧胆酸、胆酸、复合胆红素钙等制成。目前，我国仅有武汉健民大鹏药业有限公司独家生产体外培育牛黄。从其专利文献看，其生产的体外培育需要通过额外添加大量的复合胆红素钙盐与胆酸来满足药典的质量标准，这导致生产成本高昂，成品的市场价格极其昂贵，超过天然牛黄的三分之一，牛黄是牛的病理性产物，其形成的两个基本条件一是牛胆病原微生物感染，二是异物侵入胆囊。病原微生物作为多酶复合体，其代谢活动可以转化牛胆汁成分为牛黄。现代体外培育牛黄技术是模拟病理条件下牛胆结石形成过程，应用牛胆汁与微生物共培养转化形成，其化学成分与临床功效与天然牛黄相近，多数情况可等同于天然牛黄入药和临床应用。因此，选择高效的牛黄转化菌是体外培育牛黄的关键。但是牛胆汁具有广谱性抑菌作用，多数胆囊细菌不耐受胆汁，不能在胆汁中较长时间的存活，特别是一些高效牛黄转化细菌更是很难存活于胆汁中超过48小时，严重影响牛黄转化效率。目前应用现有文献报道的各类培养基（LB，TSA，BHI等）中，难以筛选出能够在牛胆汁中较长时间存活的菌株，更无法应用这类菌种与牛胆汁共培养发酵生产体外培育牛黄。因此，专利技术一种能够筛选耐受牛胆汁的高效牛黄转化菌株的特制培养基，是体外培育牛黄发酵生产的核心技术。

技术实现思路

[0003]为攻克体外培育牛黄发酵生产中菌种在发酵牛胆汁中存活时间短，不耐受牛胆汁，牛黄转化效率低的技术难题，本专利技术提供一种可有效用于筛选能够耐受牛胆汁的高效牛黄转化菌的特制培养基及其配制方法，应用本专利技术特制培养基所分离筛选的菌种具有能够长时间耐受牛胆汁、牛黄转化效率高的特点。
[0004]本专利技术解决以上技术问题，采用的技术方案如下：一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基，所述培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量1000.0ml的量，还含有牛肝提取物100.0g～300.0g、牛肾提取物100.0g～300.0g、蛋白胨5.0g～15.0g、葡萄糖3.0g～5.0g、NaCl 3.0g～5.0g、磷酸氢二钠3.0g～5.0 g、牛胆汁100.0ml～600.0 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂10.0g～30.0g，加水定容至1000.0ml，调节pH 6.8～7.5。
[0005]优选地，所述加水定容采用的水为蒸馏水或去离子；所述牛肝提取物的制备方法如下：将新鲜牛肝切成小块，匀浆成泥，得到牛肝肉泥，加入牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7～7.5，搅拌，高压蒸煮，冷却后，置于低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体用过滤去除不溶物，滤液离心，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肝提取物的冻干粉。
[0006]优选地，所述牛肾提取物的制备方法如下：将新鲜牛肾切成小块，匀浆成泥，得到牛肾肉泥，加入牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7～7.5，搅拌，高压蒸煮，冷却后，置于低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体过滤以去除不溶物，滤液离心，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肾提取物的冻干粉。
[0007]优选地，所述牛肠浸液的加入量为牛肝肉泥或牛肾肉泥的2
‑
5倍；所述牛肠浸液的制备方法为：取新鲜的牛小肠，剖开后去除内容物，冲洗干净后切成小段，匀浆成肉泥，加入3倍体积的去离子水、蒸馏水或者生理盐水，继续匀浆5～10min，过滤，滤液离心，取上清液冷冻干燥，制成牛肠浸液冻干粉；取适量牛肠浸液冻干粉用去离子水或蒸馏水配制成10
‑
20%的牛肠浸液。
[0008]进一步地，所述搅拌条件为37℃，时间为6h；所述高压蒸煮的条件为121℃，时间为1h。
[0009]优选地，所述培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂为 1000ml 的量，含有牛肝提取物200.0g、牛肾提取物250.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖3.0g、NaCl5.0g、磷酸氢二钠3.0g、牛胆汁300 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂15.0g，加蒸馏水或生理盐水定容至1000.0ml，调节pH 7.2。
[0010]上述耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基的配制方法，包括以下步骤：（1）按照配方称取或量取各组分，先将牛肝提取物、牛肾提取物、蛋白胨、葡萄糖、NaCl、磷酸氢二钠用适量蒸馏水或去离子水充分搅拌溶解；（2）固体培养基添加配方量的琼脂，再向溶液中缓慢加入配方量的牛胆汁；（3）充分搅拌溶解后，用蒸馏水或去离子水定容至1000.0ml，调节pH在6.8～7.5范围内，121℃高压灭菌20min。
[0011]优选地，步骤（2）中分别配制含牛胆汁100.0ml、200ml、300ml、400ml、500ml或/和600.0 ml的培养基，用于驯化菌种耐受牛胆汁的能力。
[0012]上述培养基用于分离筛选牛胆囊、牛胆汁、牛肾脏、牛肝脏或牛消化道中能够耐受牛胆汁的牛黄转化菌。
[0013]上述耐受牛胆汁的牛黄转化菌在体外培育牛黄上的应用。
[0014]所述培养基中添加牛肝提取物和牛肾提取物以满足牛黄转化菌繁殖的营养需求，添加牛胆汁有利于筛选出能够耐受牛胆汁的牛黄转化菌。
[0015]本专利技术的有益效果本专利技术提供了一种可有效用于筛选能够耐受牛胆汁的高效牛黄转化菌的特制培养基及其配制方法。所述培养基中添加了特制的牛肝提取物和牛肾提取物，用以满足牛黄转化菌繁殖的营养需求，添加了牛胆汁以有利于筛选出能够耐受牛胆汁的牛黄转化菌。应用本专利技术特制培养基所分离筛选的菌种具有能够长时间耐受牛胆汁、牛黄转化效率高的有益效果，攻克了体外培育牛黄发酵生产中菌种在发酵牛胆汁中存活时间短，不耐受牛胆汁，
牛黄转化效率低的技术难题。
附图说明
[0016]图1为应用本专利技术所述培养基（BBLK）筛选出的一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌株在BBLK培养基和其他3种商品培养基（BHI、LB、TSB）中繁殖的形态学观察。A，耐牛胆汁牛黄转化菌株接种在BHI液体培养基中培养48h后的形态学观察，菌体细胞分裂增殖抑制，生长缓慢；B，耐牛胆汁牛黄转化菌株接种在LB液体培养基中培养48h后的形态学观察，菌体数量减少，大量菌体细胞收缩死亡；C，耐牛胆汁牛黄转化菌株接种在TSB液体培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基，其特征在于，所述培养基的配方包括如下组分：相对于溶剂用量1000.0ml的量，还含有牛肝提取物100.0g～300.0g、牛肾提取物100.0g～300.0g、蛋白胨5.0g～15.0g、葡萄糖3.0g～5.0g、NaCl 3.0g～5.0g、磷酸氢二钠3.0g～5.0 g、牛胆汁100.0ml～600.0 ml，固体培养基在此基础上添加琼脂10.0g～30.0g，加水定容至1000.0ml，调节pH 6.8～7.5。2.根据权利要求1所述耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基，其特征在于，所述加水定容采用的水为蒸馏水或去离子；所述牛肝提取物的制备方法如下：将新鲜牛肝切成小块，匀浆成泥，得到牛肝肉泥，加入牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7～7.5，搅拌，高压蒸煮，冷却后，置于低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体用过滤去除不溶物，滤液离心，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肝提取物的冻干粉。3.根据权利要求1所述耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基，其特征在于，所述牛肾提取物的制备方法如下：将新鲜牛肾切成小块，匀浆成泥，得到牛肾肉泥，加入牛肠浸液，混合均匀，调节混合液的pH7～7.5，搅拌，高压蒸煮，冷却后，置于低温下使顶层油脂凝结成层，去除上层凝结的油脂块，下层液体过滤以去除不溶物，滤液离心，取离心后的上清液冷冻干燥，制成牛肾提取物的冻干粉。4.根据权利要求2或3所述耐受牛胆汁的牛黄转化菌筛选培养基，其特征在于，所述牛肠浸液的加入量为牛肝肉泥或牛肾肉泥的2
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5倍；所述牛肠浸液的制备方法为：取新鲜的牛小肠，剖开后去除内容物，冲洗干净后切成小段，匀浆成肉泥，加入3倍体积的去离子水、蒸馏水或者生理盐水，继...

【专利技术属性】
技术研发人员：王厚伟，窦彦玲，王康诚，张珂璠，徐凌川，李依展，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：